Вивчення взаємодії сінтаксін 6 з мембранними білками секреторних гранул нейтрофілів людини






    Головна сторінка





Скачати 66.55 Kb.
Дата конвертації24.05.2017
Розмір66.55 Kb.
Типдипломна робота

42

Міністерство загальної та професійної освіти Російської Федерації

Мордовський ордена дружби народів державний університет

імені М.П. Огарьова

факультет біологічний

Кафедра генетики

затверджую

Зав. кафедрою

д.б.н., професор Трофімов В.А ..

«___» ____________ 2001 р

Дипломна робота

тема: Вивчення взаємодії сінтаксін 6 з мембранними білками секреторних гранул нейтрофілів людини

Автор дипломної роботи: Сальникова Е.Н.

Позначення дипломної роботи: ДР-2069965-011600-14-01 група 501

Спеціальність: 011600

Керівник роботи: д.б.н., професор Набокіна С.М.

Нормоконтролер: к.б.н., доцент Мишляков Г.М.

Рецензент: д.б.н., професор Шубіна О.С.

Саранськ 2001

МОРДОВСЬКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБИ НАРОДІВ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ Н.П. Огарьова

факультет іноземних мов

Кафедра англійської мови

затверджую

Зав кафедрою

д.б.н., професор Трофімов В.А.

«____» ___________ 2001

ЗАВДАННЯ НА ДИПЛОМНУ РОБОТУ

Студентка Сальникова Олена Миколаївна група 501

Тема: Вивчення взаємодії сінтаксін 6 з мембранними білками секреторних гранул нейтрофілів людини.

Термін подання роботи до захисту: 20.06.2001 р

Вихідні дані для дипломної роботи: літературні матеріали, публікації в періодичній пресі.

Зміст дипломної роботи:

Список використаних скорочень

Вступ

Огляд літератури

Характеристика основних білкових компонентів моделі

методи

Отримані результати і їх обговорення

висновки

Список використаних джерел

Керівник роботи: ________________________ С.М. Набокіна

підпис, дата д.б.н., професор

Завдання прийняв до виконання: __________________ Е.Н. Сальникова

підпис, дата

реферат

Дипломна робота містить 44 сторінки машинописного тексту, 5 рисунків, 2 таблиці, 48 використаних джерел, з них - 40 іноземної літератури.

Перелік ключових слів: нейтрофіли, екзоцитоз, взаємодія білків, snare, vamp-1, сінтаксін 6, snap-25, snap-23.

Об'єкти дослідження: нейтрофіли периферичної крові людини.

Мета роботи: вивчення взаємодії білок-білкових взаємодій між сінтаксін 6 і іншими білками групи snare in vivo.

Методи дослідження: виділення з нейтрофілів людини snare комплексів за допомогою иммунопреципитации на моноспеціфіческіх антитіла проти сінтаксін 6, приєднаних до протеїну а-агарозе і їх харакетристики.

Отримані результати: виявлено взаємодії сінтаксін 6 з vamp-1, snap-23 і snap-25.

Список використаних скорочень

БЛМ - біслойную ліпідні мембрани

ПМЯ - поліморфноядерні лейкоцити

SNAP - білок цитозоля, що зв'язується з NSF

NSF - фактор, чутливий до N-етілмалеімід

SNARE - рецептор для SNAP

SNAP-25 - білок з молекулярною масою 25 кДа, асоційований з сінаптосомах

SNAP-23 - білок з молекулярною масою 23 кДа, асоційований з сінаптосомах

VAMP - мембранний білок, асоційований з везикулами

МПО - мієлопероксидаза

ФМА - 4бетта-форбол 12-міристат 13-ацетат

ФМСФ - фенілметілсульфонілфторід

ДДС-Na - додецилсульфат натрію

ПААГ - поліакріламідний гель

ТЕМЕД - N, N, N, N - тетраметілетілендіамін.

зміст

Список використаних скорочень

Вступ

1. Огляд літератури

1.1. Загальна характеристика нейтрофілів людини

1.2. Внутрішньоклітинні гранули нейтрофілів людини

1.3. Сучасні уявлення про механізми злипання / злиття мембран

2. Характеристика основних білкових компонентів моделі

2.1. VAMP / сінаптобревін

2.2. сінтаксін

2.3. SNAP-25

2.4. NSF

2.5. SNAP

2.6. Механізм злипання / злиття мембран

3. Методи

3.1. об'єкти дослідження

3.2. Виділення нейтрофілів людини

3.3. електрофорез білків

3.4. імуноблотинг

3.4.1. Перенесення фракцій з гелю на фільтр

3.4.2. Імунне виявлення антигенів на фільтрі

3.4.3. Активація нейтрофілів

3.4.4. іммунопреціпітація

4. Отримані результати та їх обговорення

висновки

Список використаної літератури

Вступ

Нейтрофіли і продукти їх секреції належать до числа центральних ділянок запалення. Вони відіграють ключову роль в захисті організму, поглинаючи і руйнуючи чужорідні клітини і бактерії. Нейтрофіли людини містять чотири типи гранул: азурофільние, специфічні, желатіназние гранули, а також везикули які в різній мірі здатні зазнавати екзоцитоз у відповідь на підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са +.

В даний час для пояснення молекулярного механізму екзоцитозу в нейтрофілах використовується SNARE гіпотеза. Ця модель заснована на взаємодії білків мембрани секреторною везикули і білків плазматичної мембрани з наступним зв'язуванням цитозольних білків, що призводить до злиття мембран. Групу SNARE складають білки, що відносяться до родин:

сімейство VAMP (Vesicle - Associated Membrane Protein),

сімейство SNAP-25 (Synaptosome - Associated Protein of 25 кДа),

сімейство сінтаксін.

В даний час в нейтрофілах людини ідентифіковані множинні ізоформи SNARE білків.

Виявлено, що нейтрофіли людини експресіруют широкий набір білків сімейства сінтаксін і встановлена ​​внутрішньоклітинна локалізація для двох представників цього сімейства: сінтаксін 4 і 6. В останні роки в літературі з'явилися відомості про взаємодію сінтаксін 4 з VAMP-2, SNAP-25 і SNAP-23. Що стосується білка сінтаксін 6, то в даний час взаємодії цього білка з іншими білками групи SNARE, не вивчені. Тому метою даної дипломної роботи було вивчення білок-білкових взаємодій між сінтаксін 6 і іншими білками групи SNARE in vitro, тобто в інтактних клітинах.

1. Огляд літератури

1.1. Загальна характеристика нейтрофілів людини

Нейтрофіли (поліморфноядерні лейкоцити, ПМЯ) і продукти їх секреції належать до числа центральних ділянок запалення. Вони відіграють ключову роль в захисті організму, поглинаючи і руйнуючи чужорідні клітини і бактерії [3].

Нейтрофіли мають ряд характерних рис. Це присутні у великій кількості рухливі, короткоживучі клітини, здатні до хемотаксису і фагоцитозу [1]. Загальна вага нейтрофілів у однієї людини становить 1,5 кг [6. Ці клітини є джерелом медіаторів запалення, включаючи цитокіни, і токсичних продуктів, таких як радикали кисню і гідролази. У нормі лізосомні ферменти і окисні агенти нейтрофілів, продуковані при запуску фагоцитозу, здійснюють внутрішньоклітинний катаболізм білків і інших макромолекул, деградацію фагоцитованих вірусів і бактерій. У нормі нейтрофіли знаходяться в неактивному, спокійному стані.

При патологічних станах функції цих клітин посилюються. При цьому відбувається інтенсивне генерування і вивільнення медіаторів запалення в міжклітинний простір. Ініціація каскадних протеолітичних реакцій і продукція біологічно активних пептидів, пов'язане з цими процесами, призводять до розвитку запалення [7].

1.2. Внутрішньоклітинні гранули нейтрофілів людини

Нейтрофіли людини містять чотири типи гранул: азурофільние, специфічні, секреторні везикули і желатіназние. Останні два типи були виявлені в останні 10 - 15 років за допомогою субклітинного фракціонування і імуно-електронної мікроскопії. Гранули, що належать до різних типів, відрізняються розміром, морфологією, складом і здатністю до мобілізації. Класифікація азурофільних і специфічних гранул грунтувалася на спорідненості гранул до основного барвнику Аззурового А, утриманні в гранулах мієлопероксидази і черговості появи гранул в ході міелопоеза.

Желатіназние гранули, що формуються на стадії паличкоядерних клітин, мобілізуються більш швидко, ніж специфічні гранули, утворені на стадії миелоцитов і метамиелоцитов, а специфічні гранули, в свою чергу, мобілізуються більш швидко, ніж азурофільние гранули, що з'являються на стадії промиелоцитов.

Гранули ПМЯ містять велику кількість різних ферментів, а саме протеолітичні ферменти є найбільш деструктивними [1].

Таблиця 1.1.

Субклітинних локалізація білків і ферментів в ПМЯ (Бєлова, 1997).

клас

азурофільние гранули

специфічні гранули

бактерицидні ферменти

мієлопероксидази

лізоцим

лізоцим

протеїнази

еластаза

катепсин G

протеиназа З

катепсин В

катепсин Д

коллагеназа

інші гідролази

N-Ацетил - глюкозамінідаза

-глюкоуронідаза

-гліцерофосфатаза

-маннозідаза

сульфатази

нуклеази

лужна фосфотаза

інші білки

лактоферин

Білки, що зв'язують вітамін В12 2 -микроглобулин

Ферменти нейтрофілів, діючи спільно, можуть руйнувати еластин, колаген і різні інші білки, активувати комплемент, утворювати кініни з різних кининогенов, а також підвищувати проникність судин [8].

У азурофільних гранулах нейтрофілів і моноцитів міститься також мієлопероксидаза (МПО) - гемопротеинов з молекулярної масою 150 кДа; цей фермент каталізує окислення іонів гамедов (особливо J -) до гіпогаметов [3]. У поєднанні з Н 2 О 2 і гамедамі, особливо йодидом і бромідом, МПО токсична для різних клітин, в тому числі для мікроорганізмів, пухлинних клітин, нормальних еритроцитів, тромбоцитів та інших лейкоцитів. Хоча фагоцитирующие клітини зазвичай продукують пероксид водню (Н 2 О 2), бактерії, що не продукують каталази, здатні виробляти достатню кількість Н 2 О 2 для власного руйнування [8]. Продукти окислення системи МПО можуть також викликати вивільнення васоактівних амінів з тромбоцитів і огрядних клітин [6]. МПО має низку інших функцій, наприклад вона інактивує окислення хемотаксичних олігопентідов, що містять метіонін [39]. Специфічні гранули нейтрофілів містять лактоферин - білок з молекулярною масою 90 кДа, в якому є дві ділянки, зв'язування заліза. Цей білок вивільняється в позаклітинний простір разом з іншими ферментами гранул [2]. Залізо, пов'язане з лактоферрином, може відігравати певну роль в генерації ОН з О2 і Н 2 О 2.

Іншим важливим ферментом нейтрофілів, що грає, мабуть, певну роль у розвитку стійкості до бактеріальної інфекції, є лізоцим. Лізоциму - це ферменти, що розчиняють різні гликозидні зв'язку між N-ацетилглюкозамін і N-ацетилмурамовой кислотою, що веде до лізису клітинних стінок мікроорганізмів, а також і до істотного впливу на мембрани клітин ссавців [22].

З огляду на вміст гранул обох типів, можна помітити, що набір цих ферментів достатній для деградації багатьох або всіх ліпідів, полісахаридів і білків чутливих бактерій, часто приводить до деструкції. Ці ферменти можуть діяти як всередині клітини, так і поза нею. Якщо фермент функціонує всередині клітини, частка, доставляється в клітини фагосомою. При просуванні містить частинки фагосоми всередину клітини вона зливається з азурофільной і специфічними гранулами і утворює фаголізосому; при цьому частка, що міститься в фагосоме піддається дії ферментів і інших речовин, що знаходилися в гранулах. Гранули формуються в апараті Гольджі на проміжній стадії розвитку в кістковому мозку. Злиття фагосом зі специфічними гранулами відбувається через 30 секунд після початку фагоцитозу, тоді як злиття з азурофільной гранулами через 1-3 хв. [1].

Багато з ферментів специфічних гранул найбільш активні при нейтральному або лужному рН, тоді як більшість ферментів азурофільних гранул найбільш активні при кислих значеннях рН.

Вивільнення з клітки гранулярних ферментів найлегше спостерігати при посиленому фагоцитозі, коли знову фагоцітіруемий частинки потрапляють в уже сформовану фаголізосому [2]. Вивчення вивільнення вмісту гранул в середу часто проводять в присутності цітохалазін В; нейтрофіли перетворюються в клітини з низькою фагоцитуючої активністю, легко вивільняють продукти гранул в середу. Вивільнення гранулярних ферментів можна спостерігати і без цітохалазін В - під впливом самих різних частинок. До числа найбільш ефективних стимулів відносяться містять молекули JgG великі комплекси антигену з антитілом [1]. Вивільнення ферментів з специфічних гранул відбувається в цілому з більшою інтенсивністю ніж у азурофільних гранул. Більшість стимулів викликає однакове вивільнення ферментів з специфічних і азурофільних гранул, серед них є і такі, які індукують специфічні гранули, наприклад Кон А, ФМА.

Ферменти нейтрофілів здатні функціонувати як всередині клітини при фагоцитозі, так і поза клітиною при екзоцитозу.

Гранули нейтрофілів є джерелом важливих мембранних білків - рецепторів, антигенів, ферментів. В ході екзоцитозу ці білки вбудовуються в плазматичну мембрану нейтрофіла і значно змінюють здатність клітини до взаємодії з її оточенням.

1.3. Сучасні уявлення про механізми злипання / злиття мембран

Злипання і злиття мембран - універсальний і нормальний процес, важлива стадія гетерологічного і гомологічного межмембранного взаємодії в ході екзоцитозу; в ході аутоімунних реакцій (наприклад, при злитті макрофагів з лімфоцитами).

Механізми злиття клітинних і модельних (штучних) мембран включає в себе одні й ті ж стадії, що вказує на універсальний механізм взаємодії мембран. Ці ж механізми поширюються і на злиття мембран внутрішньоклітинних органел, везикул з плазмалеммой, де важливо враховувати специфічні підготовчі стадії, що ведуть до злиття. Механізми злиття в системах клітина-клітина, клітина-везикула (найчастіше секреторні гранули), везикула-везикула, везикула-плазмалемма, везикула-плоскі біслойную ліпідні мембрани (БЛМ), БЛМ-БЛМ. Злиття, ймовірно, відбувається тільки в специфічних ділянках ліпідного бішару мембран. Основний ендогенний фактор злиття - іони Са - різко знижує гідротаціонних бар'єр при злитті мембран. Крім того, іони Са знижують (або нейтралізують) негативний поверхневий заряд, безпосередньо модифікують структуру ліпідного бішару, викликають поділ ліпідів в бішару, дестабілізуючи їх; створюють кальцієві містки між двома контактуючими мембранами, індукуючи злиття.

Полярні амфідільние молекули (ненасичені жирні кислоти, моноацілгліцерінов), полікатіони (полілізину), вуглеводні (декан), продукти перекисного окислення ліпідів, диметилсульфоксид, є індукторами злиття. Процеси злиття передує агрегацией везикул, слипанием (адгезію) мембран. Процесам злиття супроводжують вивільнення вмісту везикул в зовнішній розчин.

Сам акт злиття включає кілька стадій: часткове (полусліяніе і повне злиття, що супроводжується на останніх етапах стабілізацією перехідних структур, появою особливих кохлеарних внутрімембранних частинок і найголовніше, об'єднанням внутрішніх обсягів клітин або везикул. Зниження щільності поверхневого заряду, збільшення іонної концентрації середовища, зниження рН середовища і введення полікатіонов сприяє зближенню і контакту мембран. Підвищення в'язкості середовища заважає зближенню, але полегшує утворення контакту вже зближених м ембран. Деформація клітинної поверхні - важливий фактор злипання і злиття мембран.

Щільний контакт обох мембран спочатку призводить до утворення пенталамінарной, а потім тріламінарной структури (діафрагми). Остання утворюється після поступового витіснення двох зайвих шарів мембран на периферію області контакту. Тріламінарная структура - це новий одинарний бішар в зоні контакту, утворений з двох сблизившихся і контактують бішару. Освіта тріламінарной структури - універсальний процес межмембранного взаємодії.

Додавання іонів Са в малій концентрації в суспензію мембранних везикул викликає агрегацію, але не злиття останніх. При досягненні порогової концентрації Са 2+ відбувається ізотермічний фазовий перехід фосфоліпідів з рідкого стану в кристалічний і індукується злиття. Іони Mg підвищують температуру фазового переходу фосфоліпідів в меншій мірі, ніж Са 2+. Звідси випливає, що коли Са 2+ викликає злиття везикул, фосфоліпіди в присутності Mg 2+ залишаються в рідкому стані і спостерігається агрегація везикул. Це вказує на те, що дестабілізація бішару при злитті обумовлена ​​утворенням кластерів твердих ліпідів в рідкому бішарі.

Структурні перебудови і освіту тріламінарной структури можуть відбуватися двома шляхами: локально, в зоні «точкового» контакту, в цьому випадку утворюється сталк (перемичка); в зоні щільного дегидратированного контакту (адгезія) на значній площі мембрани.

Сталкерний механізм передбачає, що в зоні точкового контакту присутні асиметричні молекули ліпідів, ділянки нестабільності. При контакті ці молекули хаотично рухаються до тих, поки не утвориться тріламінарная структура. Адгезійний механізм передбачає утворення в зоні контакту зворотних міцел, подібних гексагональної фазі, в зоні контакту порушується стійкість плоскої упаковки моношарів, останні перетворюються на зворотні міцели.

У нормальних умовах злипання і злиття клітин відбувається порівняно рідко (в залежності від функціонального стану клітин). Мабуть, мембранні компоненти різних гранул відповідальні за селективну дегрануляцію.

У той час як в нейтрофілах механізми екзоцитозу не ясні, в нейрональних і дріжджових клітинах механізми і білковий апарат секреції вивчені досить детально. Моделі злиття мембран, що отримала назву SNARE гіпотеза. Ця гіпотеза, вперше запропонована для екзоцитозу синаптичних пухирців, мабуть, носить універсальний характер і справедлива як для конститутивного, так і регульованого злиття мембран.

SNARE гіпотеза заснована на взаємодії цитозольних білків NSF (N - ethylmaleimide-sensitive factor) і SNAP (soluble NSF attachment protein) з їх рецепторами, названими SNARE (від поєднання англійських слів SNA P R ECEPTOR). Під терміном SNARE традиційно об'єднують три групи білків: синтаксиси, сінаптобровіни / VAMP (vesicle - associated membrane protein) і SNAP-25 (synaptosome - associated protein of 25 кДа) [45]. Нижче представлена ​​характеристика SNAP, NSF і SNARE, після чого розглянуто механізм злиття мембран за участю цих білків.

2. Характеристика основних білкових компонентів моделі

2.1. VAMP / сінаптобревін

Сімейство VAMP / сінаптобревінов об'єднує інтегральні мембранні білки з молекулярною масою близько 18 кДа. Два представника цього сімейства VAMP-1 (сінаптобревін 1) і VAMP-2 (сінаптобревін 2) вперше були виявлені і охарактеризовані в везикулах нейтральних клітин [9]. Білки являють собою продукти двох окремих генів, експресія яких різним чином регулюється в нейронах [30]. В даний час ненейрональная гомологи VAMP-1 і VAMP-2 ідентифіковані в самих різних клітині [13]. Одна з ізоформ VAMP, а саме VAMP-3 / селлюбревін, характерна тільки для ненейрональная клітин [35].

У молекулярній структурі білків цього сімейства можна виділити NН 2 - кінцевий район, збагачений залишками промити (аспарагина), гідрофільний центральний ділянку - «кор» -протяженностью в 70 амінокислотних залишків і СООН - кінцевий мембранний домен. У деяких білках, зокрема VAMP з Aplysia Californica і Drosophila melanogaster, на С-кінці молекули присутній невеликий домен, звернений в порожнину везикули [20]. Гідрофільний «кор» є досить консервативним і незначно змінюється при переході від однієї ізоформи до іншої. Навпаки, в межах N-кінцевого району сконцентровані амінокислотні домени, що відрізняють білки цього сімейства.

VAMP / сінаптобревінам властива мембранна топологія і асоціація з мембранами секреторних везикул. У зв'язку з цим білки були названі V-SNARE (від англійського слова vesicle - везикула). Для деяких нових ізоформ VAMP виявлений незвичайний зразок внутрішньоклітинної локалізації білка. Так, зокрема, VAMP-5 пов'язаний з мембраною міобластів, VAMP-1А ідентифікований в плазмалемме, а VAMP-1В в мітохондріях клітин ендотелію [28].

У багатьох клітинах, здатних як конститутивний, так і регульованою секреції, виявлені білки, гомологічні VAMP.

Комбінація методів субклітинного фракціонування і іммуноцітохіміческіе методів дозволила встановити наявність VAMP-іммунореакцівних білків в гранулах різних клітин з регульованим типом секреції. Так, зокрема, ці білки ідентифіковані в адипоцитах [19], зімогенових гранулах ацинарних клітин підшлункової залози щура [17, інсулін-містять гранулах клітин острівців Лангерланса підшлункової залози щура, специфічних гранулах нейтрофілів людини [16], тубувезікулах пристінкових клітин шлунка [18 ], акросомальних везикулах сперматозоїдів і кортикальних гранулах яйцеклітин [21] морського їжака. Для гомологів VAMP-2 простежується більш широкий зразок поширення в зазначених клітинах, ніж для іншої білкової ізоформи - VAMP-1.

VAMP-3 / селлюбревін був виявлений у всіх досліджених клітинах і тканинах щура, що вказує на залучення цього білка в процеси конститутивного транспорту везикул [35]. Експерименти по визначенню внутрішньоклітинної локалізації селлюбревіна показали, що білок знаходиться переважно в структурах ендосомного походження.

Результати трьох незалежних експериментальних підходів вказують на участь білків сімейства VAMP / сінаптобревінов в секреції. По-перше, ці білки взаємодіють з цитозольними білками NSF, а також - і -SNAP, які є важливими чинниками злиття мембран [47].

По-друге, VAMP / сінаптобревіни є мішенями для протеолітичної деградації клострідіальном нейротоксинами - тетанусним токсином і ботулінічний токсин серотипів В, D, F, G [39], які блокують вивільнення нейротрансмітера в синапсах.

По-третє, важлива роль VAMP / сінаптобревінов в процесах секреції підтверджується результатами генетичних експериментів на дріжджах Saccharomyces cerevisial. Так, мутації в дріжджах по генам, що кодує гомологи VAMP, призводять до значних порушень конститутивний секреції [24]. При цьому мутації за різними ізоформами блокують різні етапи секреторного процесу: транспорт везикул і ЕПР в апарат Гольджі, з апарату Гольджі до плазматичної мембрани і з апарату Гольджі до вакуолі [42]. Мутації в цих генах призводять до порушення секреції, яке виражається в накопиченні везикул, нездатних зливатися з плазмолеммой.

2.2. сінтаксін

Сінтаксін представляють мультігенное сімейство інтегральних мембранних білків з молекулярною масою 35 кДа. Перший представник цього сімейства, сінтаксін 1А / 1В, був ідентифікований в нейронах щура в морфологічно детермінованому ділянці плазматичної мембрани, що формує зону синаптичного контакту [11]. Білок демонстрував здатність до взаємодії з мембранним білком синаптичної везикули, синаптотагмін (р65), і кальцієвих каналом N-типу, який, залучений в регуляцію вивільнення нейротрансмітера. Базуючись на цих спостереженнях, автори запропонували участь сінтаксін в злипанні / злиття мембрани синаптичного бульбашки з пресинаптичної мембраною.

Множинні ненейрональная гомологи сінтаксін 1А / 1В були знайдені в самих різних організмах: від дріжджів до людини [12]. При цьому спостерігається виборчий характер поширення окремих представників в специфічних клітинних фетотіпах. Так, сінтаксін 1А / 1В присутній виключно в нейрональних і нейроендокринних клітинах. Сінтаксін 2, 4 і 5 досить широко поширені в різних клітинах і тканинах ссавців. У нейтрофілах людини також був ідентифікований представник сімейства сінтаксін, сінтаксін 4 [16].

Сінтаксін є досить консервативними білками. Порівняння амінокислотних послідовності шести різних ізоформ, присутніх в тканинах щура, показує 30-90% -ву ступінь гомології між окремими білками [12]. При цьому ступінь гомології між сінтаксін 1А і 1В становить 90%, між сінтаксін 2-4 і сінтаксін 1А / 1В варіює від 46 до 64%, а між сінтаксін 5 і іншими білками становить лише 23-26%. Сінтаксін властиві спільні риси структурної організації білкових молекул. Молекули цих білків протяжністю в 288-301 амінокислотних залишків містять на карбоксильних кінці транс-мембранний домен. Цей домен грає важливу роль в «заякоріванню» білка в мембрані, а також, і в детермінування внутрішньоклітинної локалізації білка [34]. Кожен член сімейства сінтаксін містять кілька доменів, здатних до утворення різних спіральних -спіралей, структур, які беруть участь в міжмолекулярних білок-білкових взаємодіях. Слід зазначити, що сінтаксін властиво величезна різноманітність білок-білкових взаємодій. Встановлено, що сінтаксін взаємодіє з сінколліном, білком зімогенових гранул підшлункової залози [22], томосіном, тубуліном, кінази 5 і деякими іншими білками. Функціональне значення цих взаємодій в даний час з'ясовується.

Для сінтаксін характерна асоціація з акцепторной мембраною, що є мішенню для транспортної везикули. Тому сінтаксін відносять до t-SNARE (від англійського слова target - мішень).

У клітинах, здатних до регульованого екзоцитозу, сінтаксін, головним чином, асоційовані з мембраною. Однак нещодавно в літературі з'явилися повідомлення про існування пулу сінтаксін в мембранах секреторних везикул. Так, імуно-електронної мікроскопії встановлено присутність сінтаксін 1А в мембранах синаптичних бульбашок [33], а в зімогенових гранулах підшлункової залози виявлено сінтаксін 3. Ці дані суперечать традиційній точці зору про сінтаксін, як і білках, що функціонують за типом t-SNARE. При цьому не ясно, чи є везикулярний пул сінтаксін функціонально значущим.

Як і в разі VAMP / сінаптобревінов, роль білків сімейства сінтаксін в процесах секреції подверждается трьома лініями доказів. 1) Гомологи сінтаксін в дріжджах (білки Sso1, Sso2, Pep12, Sed5, T1g1p, T1g2p) необхідні для транспорту внутрішньоклітинних везикул [24]. Білки Sso1 і Sso2 найбільш споріднені нейрональних сінтаксін. 2) ботулінічного токсин серотипу С1, разщепляющій молекули сінтаксін, уповільнює вивільнення нейротрансмітера. 3) сінтаксін взаємодіє з NSF та SNAP, білками, необхідними для транспорту везикул через мембрани апарату Гольджі [12].

2.3. SNAP-25

SNAP-25 належить до сімейства еволюційно консервативних білків, члени якого абсолютно необхідні для екзоцитозу. SNAP-25 був початково виявлений в сінаптосомах. Білок локалізується в пресинаптичної мембрани, в зв'язку з чим його, як і сінтаксін, відносять до t-SNARE.

На відміну від сінаптобревіна і сінтаксін SNAP-25 не є інтегральним мембранним білком. Молекули SNAP-25 асоційовані з мембраною, за рахунок жирнокислотних груп, що модифікують залишки цистеїну в центральній частині молекули [27]. В ході альтернативного сплайсингу РВК утворюються дві нейронспеціфічние ізоформи SNAP-25, А і В, які містять амінокислотні заміни в ділянці молекули, залучених в асоціацію з мембраною. Ці ізоформи мають різні кількісні та анатомічні зразки експресії в нейронах при розвитку мору, що вказує на можливість їх участі в різних секреторних процесах.

Як і для описаних вище SNARE, на роль SNAP-25 в секреції вказують дані по осадженню цього білка на NSF / SNAP афінних сорбентах і деградації нейротоксинами [39].

До недавнього часу вважалося, що SNAP-25 експресується виключно в нервовій системі і нейроендокринних клітинах, таких як острівці Лангерганса підшлункової залози, хромафінні клітини наднирників, ентерхромаффінние клітини шлунка. Однак експресія білка виявлена ​​також, хоча і в дуже малих кількостях, в обмеженому наборі ненейрональная клітин, зокрема скелетних м'язах і клітинах жирової тканини [31]. Цікаво, що обидва зазначених об'єкта містять інсулін-залежний транспортер глюкози, GLUT 4. Транспортер знаходиться у внутрішньоклітинних везикулах, а при стимуляції клітин інсуліном зазнає транслокацію до плазматичної мембрани. SNAP-25 бере участь в транслокації GLUT 4 по типу регульованого екзоцитозу. Зовсім недавно SNAP-25 виявлено в ряді ненейрональная об'єктах, сперматозоїдах морського їжака, де він бере участь в акросомной реакції, і яйцеклітинах миші [28].

Якщо SNAP-25 дійсно грає ключову роль в процесах секреції, цей білок або його гомологи повинні бути присутніми у всіх клітинах, здатних як до конститутивний секреції, так і до регульованого екзоцитозу. Равічандран з співробітниками клонуванні нову ізоформу SNAP-25, названу SNAP-23, яка демонструє 72% -ву гомологію по амінокислотної послідовності зі SNAP-25В. Ізоформа була знайдена у всіх досліджених тканинах щура, в тому числі мозку. У нейтрофілах людини також недавно було виявлено експресія SNAP-23; причому білок, мабуть, присутній в цих клітинах в двох ізоформах, позначених SNAP-23А і SNAP-23В [37].

Поширення SNAP-23 в клітинах і тканинах вказує на можливість участі цього білка в конститувною секреції, в той час як SNAP-25, мабуть, потрібно для регульованої секреції.

2.4. NSF

NSF представляє цитозольний білок з молекулярною масою 76 кДа, що володіє АТФазной активністю. Молекула білка містить в своєму складі два АТФ-зв'язуючих домену, які необхідні для забезпечення процесу злиття мембран. Мутантні форми білка містять окремі амінокислотні заміни в АТФ-зв'язуючих доменах, не здатні каталізувати гідроліз АТФ, що призводить до порушень в секреції [48]. АТФазна активність NSF індукується комплексом SNAP-сінтаксін [9]. NSF виконує універсальну функцію у всіх клітинах і потрібно для злиття транспортної везикули з різними акцепторними мембранами як в ході конститутивний, так і регульованою секреції.

2.5. SNAP

Білки сімейства SNAP є цитозольними білками з молекулярною масою близько 35-40 кДа, які забезпечують зв'язування NSF з мембранами, що перетерплюють злипання / злиття [48]. SNAP існує в тих ізоформах, названих -, - і -SNAP. Два з цих білків, і знайдені в самих різних клітинах і тканинах, в той час як -SNAP виявляється виключно в мозку. і ізоформи діють спільно в процесах транспорту везикул між мембранами апарату Гольджі, і обидва ці білка потрібні для оптимального зв'язування NSF з мембранами [45]. Однак слід зазначити, що хоча обидва білка прямо взаємодіють з NSF, тільки -SNAP, контактує з мембранним рецептором (SNARE) [44].

Роль і изоформ універсальна, в той час як -SNAP, виконує якусь спеціалізовану функцію. Цікаво при цьому відзначити, що синаптотагмін I, нейрон-специфічний білок, взаємодіє з -SNAP, але не здатний зв'язуватися з двома іншими ізофорамамі SNAP [45]. Цілком можливо, що це білок - білкове взаємодія необхідно для здійснення нейросекреції.

2.6. Механізм злипання / злиття мембран

Молекулярний механізм злипання / злиття мембран, SNARE гіпотеза, запропонований початково для злиття мембрани синаптичної везикули з пресинаптичної мембраною [47], представлений на рис.2.1. Гіпотеза носить універсальний характер.

Початково, перед складанням функціонального білкового комплексу сінтаксін пов'язаний з білком цитозолю n-sec1, а VAMP з мембранним білком везикули, сінаптофізіном. Білки n-sec1 і сінаптофізін запобігають сінтаксін і VAMP від ​​асоціації в іншими SNARE і є негативними регуляторами секреції. В ході стикування і злипання мембран n-sec1 асоціює від сінтаксін, а сінаптофізін від VAMP, що призводить до утворення SNARE комплексу (коефіцієнт седиментації 7s), що складається з синтаксису, SNAP-25, VAMP і сінаптотагніна.

Синаптотагмін є обов'язковий компонент SNARE комплексу тільки в нейронах і деяких клітинах, здатних до регульованої секреції.SNARE комплекс є високоаффіннимі рецептором для цитозольних білків NSF і -SNAP. Приєднання до комплексу -SNAP призводить до одночасного вивільнення з нього сіноптотагміна. NSF, що володіє АТФазной активністю, гідролізує АТФ.

Існування білкових комплексів, постульованих SNARE гіпотезою, було продемонстровано експериментально, зокрема, іммунопреціпітація з екстракту мозку [15]. SNARE комплекси, що містять гомологи сінтаксін, VAMP і SNAP-25 були виявлені і виділені з дріжджів [47], хромафинних клітин надниркових залоз [36], адипоцитів миші [44].

Нещодавно були отримані дані щодо взаємодії in vivo - у аксонах і нейром'язових синапсах - сінтаксін, SNAP-25 і VAMP [46].

Експерименти щодо зв'язування білків in vitro продемонстрували існування бінарних комплексів з мікромолярних аффинностью між VAMP і сінтаксін, VAMP і SNAP-25, сінтаксін і SNAP-25 [17] .Деякі з цих білок-білкових взаємодій виявляють певну селективність по відношенню до різних ізоформ SNARE. Так, наприклад, VAMP-1 зв'язується з сінтаксін 1 і 4, але не приєднується до сінтаксін 2 і 3 [19]. Цілком можливо, що пативністю клітинах VAMP-1 за допомогою зв'язування з певною изоформой сінтаксін бере участь в різних секреторних процесах. Не виключена і ймовірність того, що зазначені взаємодії VAMP з сінтаксін взагалі не реалізуються in vivo через вкрай низькою афінності білків. Додавання ж в безклітинну систему SNAP-25 значно підвищує спорідненість сінтаксін до VAMP і призводить до створення високоафінного комплексу [23]. Структурні зміни в молекулах SNARE були продемонстровані in vitro при складанні і розбиранні тримерного комплексу [17].

У молекулі SNAP-25 сінтаксін - связивющій домен займає N-кінцеву половину молекули. Сінаптобревін - зв'язує домен SNAP-25 розташований в С-кінцевій частині молекули.

Зовсім недавно в літературі з'явилися дані двох незалежних лабораторій про виявлення мінімального «коров'ячого» комплексу SNARE, стійкого до протеолізу, і ідентифікації фрагментів білкових молекул, достатніх для складання функціонального тримерного комплексу. Мінімальний «кор» включає цитоплазматичний домен VAMP / сінаптобревіна, С-кінцевий фрагмент молекули сінтаксін, а також N- і С-кінцеві ділянки молекули SNAP-25. N- і С-кінцеві фрагменти SNAP-25 можуть функціонувати як незалежні домени і окремо зв'язуватися з VAMP і сінтаксін з утворенням стабільного комплексу [41].

SNARE гіпотеза постулює, що обов'язковою умовою ефективного злиття мембран є наявність v- і t-SNARE на різних мембранах.

Згідно SNARE гіпотезі, транспортна везикула дізнається відповідну акцепторну мембрану за рахунок специфічного зв'язування мембранних білків везикули (v-SNARE) з їх строго визначеними партнерами на акцепторной мембрані (t-SNARE). NSF і SNAP, повсюдно распротраненіе цитозольні білки, не є чинниками, що визначають специфічність злиття.

Специфічність, постулируемая SNARE гіпотезою, дозволяє пояснити присутність в одній і тій же клітині декількох різних ізоформ SNARE. По-перше, ізоформи можуть брати участь в різних секреторних процесах. Наприклад, окремі гомологи сінтаксін потрібні для міграції транспортної везикули з ЕПР в апарат Голджі, з Гольджі в плазматичну мембрану до вакуолі [15]. По-друге, одна і та ж изоформа може функціонувати в складі різних SNARE комплексів при об'єднанні з різними білками і брати участь в різних секреторних події.

Питання про те, на якій стадії злиття мембран функціонують SNARE, представляється вкрай важливим для формування цілісного уявлення про механізми секреції і факторах її реалізують. Відомо, що процес Са 2+ -Регульований секреції складається з чотирьох основних стадій: 1) «рекрутування» везикул, 2) «заякоріванню» / злипання везикул з плазматичною мембраною, 3) «праймування» / підготовка везикул до злиття з мембраною і, нарешті, 4) Са 2+ -трімерное злиття мембран [2].

Раніше передбачалося, що SNARE комплекс утворюється на стадії заякоріванню і необхідний для здійснення процесу злипання мембрани везикули і плазмалеммой.

Ці дослідження свідчать про важливу роль SNAP-25, VAMP і сінтаксін в пізніх стадіях екзоцитозу. Деякі з SNARE ідентифіковані в нейтрофілах людини. В даний час ідентифіковано наступні SNARE білки: два білки сімейства VAMP (VAMP-1 і VAMP-2), два білка сімейства SNAP-25 (SNAP-25 і SNAP-23), і широкий набір білків сімейства сінтаксін, а саме сінтаксін 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 і 16. Виявлено дві ізоформи сінтаксін 3: сінтаксін 3А, ідентичний раніше відомому сінтаксін 3, і нова изоформа, сінтаксін 3В. Множинні ізоформи SNARE білків ідентифікованих в нейтрофілах людини, мабуть, могли б брати участь у екзоцитозу різних типів гранул і, тим самим бути факторами, що забезпечують селективний характер дегрануляции. Однак інформація про взаємодії SNARE білків в цих клітинах вкрай неповна. Тому певний інтерес для встановлення молекулярних механізмів екзоцитозу представляє з'ясування окремих міжбілкового SNARE-SNARE взаємодій. Основною метою даної роботи є з'ясування взаємодії сінтаксін 6 з іншими SNARE.

3. Методи

3.1. об'єкти дослідження

У даній роботі об'єктом дослідження були нейтрофіли периферичної крові людини. В якості контролю використовували екстракт мозку щура, де присутні всі нейтрон-специфічні SNARE.

3.2. Виділення нейтрофілів людини

Виділення нейтрофілів людини здійснювали за методом Моллінедо (Mollinedo F. et al., 1989). Клітини виділяли з 20 мл крові, взятої у здорових донорів. Залишали на 1-2 години при кімнатній температурі для седиментації еритроцитів. Верхній світлий шар суспензії відбирали і піддавали центрифугированию при 1200 об / хв протягом 10 хв. Супернатант відкидали, а осад, обогашенний лейкоцитами, ресуспендіровалі в 3 мл РВS, після чого суспензію нашаровується на 3 мл Ficoll / Hypaque і центрифугували при 1500 об / хв протягом 40 хв. PBS містить натрій фосфорнокислий двозаміщений 12-водний в концентрації 0,02 моль / л, натрій фосфорнокислий однозаміщений 2-водний в концентрації 0,02 моль / л і натрій хлористий в концентрації 0,1 моль / л. Отримували верхній шар (PBS), проміжний шар (лімфоцити, моноцити, тромбоцити), нижній шар (Ficoll / Hypaque) і осад. Осад, збагачений нейтрофілами, суспендованих в 2 мл PBS, переносили в попередньо зважену центрифужную пробірку, додавали 6 мл води і інкубували протягом 2 хв. При цьому домішкові еритроцити, присутні в осаді, будуть зруйновані в зазначених умовах гіпотонічного лізису, а нейтрофіли зберігають свою цілісність. По закінчення часу інкубації осматіческое тиск відновлювали додаванням 2 мл 3,6% розчину NaCl, після чого нейтрофіли облягали центрифугуванням при 1000 об / хв протягом 5 хв. Осад зважували і визначали кількість виділених нейтрофілів з розрахунку, що 10 6 клітки мають вагу 1,22 мг.

3.3. електрофорез білків

Білковий склад препаратів оцінювали за допомогою диск-електрофорезу в присутності ДДС-Na за методом Леммлі з модифікаціями. Використовували прилад для вертикального електрофорезу (осередок для електрофорезу Mini-PROTEAN, BIO-RAD, Швеція). Поділ білків приводили в міні-гелях. Залежно від молярної маси цікавить білка в якості розділяє гелю використовували 12% поліакріламідний гель, а в якості концентрує - 6% поліакріламідний гель. Розчини для гелів готували згідно з таблицею:

Таблиця 3.1.

Кінцева концентрація речовин для приготування гелів.

вихідні розчини

Процентний вміст акриламіду

6%

12%

0,5 Мтріс рН 6,8

0,125 М

-

1,5 Мтріс рН 8,8

-

0,375 М

30% акриламід

6%

12%

10% ДДС-Na

0,1%

0,1%

1% персульфат амонію

0,075%

0,05%

100% ТЕМЕД

0,015%

0,01%

Розділяє гель полимеризованной протягом 1 години при кімнатній температурі. Про завершення полімеризації судили по появі різкого розмежування між гелем і дистильованою водою, яку нашаровуються на розділяє гель. Після закінчення полімеризації акриламіду воду видаляли. До складу електродного буфера входили 0,025 М трис - HCl, рН 8,3; 0,191 М гліцин, 0,1% ДДС-Na. При приготуванні проб білка для електрофорезу змішували 3 об'єму розчину білка з 1 об'ємом 4-кратного буфера для приготування проб. Буфер для приготування проб містить 62,5 мМ трис - HCl, рН 7,4, 2,5% ДДС-Na, 12% сахарозу, 1% ДТТ. Перед електрофорезом пробу білка кип'ятили на водяній ванні 5 хвилин. Кількість білка, що наноситься на лунку, варіювали в залежності від цілей експерименту. В якості стандартів використовували забарвлені білки - маркери LMW фірми LKW (Швеція). Білки - маркери: -Лактальбумін - 14,4 кДа, Карбоангидраза - 30 кДа, інгібітора трипсину з сої - 20,1 кДа, Овалбумін - 43 кДа, Бичачий сироватковий альбумін - 67 кДа, фосфорилазу b - 94 кДа.

Електрофорез проводили в режимі: 10 хв при 25 В для входження білків в гель, а потім 1-1,5 год при 120 В до початку виходу бромфенолового синього з гелю.

Після електрофорезу гелі або фарбували Кумассі R-250, або піддавали імуноблотинг. У першому випадку гелі фіксували в суміші метанол: оцтова кислота: вода (50:10:50), фарбували 0,125% -ним розчином Кумассі яскраво блакитного R-250 в суміші етанол: оцтова кислота: вода (50:10:40), видаляли фон в розчині етанол: оцтова кислота: вода (15: 7,5: 77,5) і зберігали в 7% -ної оцтової кислоти.

3.4. Імуноблотинг

Імуноблотинг виконували в три основних етапи: 1) фракціонування зразка (см.3.3.), 2) перенесення фракцій на фільтр (власне блот), 3) імунне виявлення антигенів на фільтрі.

3.4.1. Перенесення фракцій з гелю на фільтр

Білки переносили з гелю на фільтр електрофоретичних пометоду Тоубіна з модифікаціями. Використовували нітроцелюлозні фільтри з діаметром пор 0,2 мкм. Перенесення здійснювали в приладі для перенесення (BIO-RAD, Швеція) (рис.3.1), слідуючи протоколу фірми.

Прилад для перенесення білків (BIO-RAD, Швеція).

Рис.3.1.

До складу буфера для перенесення входили 0,025 М трис - HCl, рН 8,3, 0,192 М гліцин, 20% метанол. Готували «сендвіч», що складається з послідовно покладених один на одного 1 листа фільтрованого паперу, нітроцелюлози, гель і 1 листа фільтрованого паперу. Такий «сендвіч» щільно затискали між двома губчастими прокладками і поміщали в камеру для перенесення. Перенесення проводили при кімнатній температурі в режимі стабілізації за напругою (100 В) протягом 1,5-2 годин.

Після закінчення перенесення фільтр піддавали імунної фарбування.

3.4.2. Імунне виявлення антигенів на фільтрі

Імунне виявлення антигенів на фільтрі виконували за методом Тоубіна з модифікаціями. Після закінчення електропереносу фільтр промивали в РВS (50 мМ трис HCl, рН 7,5, що містить 150 мМ NaCl) протягом 5 хв, а потім інкубували в РВS, що містить 0,05% Твін - 20 і 2% сухого знежиреного молока протягом 1 години. Ця стадія необхідна для блокування вільних ділянок мембрани і запобігання подальшій неспецифічний сорбції антитіл на ці ділянки. Фільтр відмивали 5 хвилин в Т-РВS (РВS, що містить 0,05% Твін - 20), а потім інкубували з первинними антитілами, взятими у відповідних розведеннях в Т-РВS (1: 1000), протягом ночі при 4 С. Потім фільтр відмивали Т-РВS (3 рази по 10 хвилин) і інкубували з біотінілірованние антімишіннимі або антикроличьих JgG, взятими в розведенні 1: 1000 в Т-РВS, протягом 1 години. Від незв'язаних імуноглобулінів фільтр відмивали 3 рази по 10 хвилин в Т-РВS, а потім інкубували з кон'югатом стрептавидин-пероксидаза хрону, узятим в розведенні 1: 1000 в Т-РВS, протягом 1 години. Після закінчення інкубації фільтр відмивали в Т-РВS 5 разів (перші дві відмивання були по 15 хвилин, а три останні по 5 хвилин).

Моніторинг іммобілізованих антигенів проводили за допомогою фарбування в 10% розчині діамінобензідіна в 0,1% Т-РВS, що містить 3% Н 2 О 2.

3.4.3. Активація нейтрофілів

Виділені нейтрофіли ресуспендували в Hepes / глюкозно буфері (10 мМ HEPES, рН 7,5, що містить 150 мМ NaCl, 5 мМ КОН, 1,2 мМ MgCl 2, 1,3 мМ CaCl 2, 5,5 мМ глюкози) до концентрації 1 -310 7 клітин / мл. Клітинну суспензію ділили на аліквоти по 500 мкл., Які або поміщали в крижану баню (для дослідження антигенів у покояться клітинах) або піддавали дії агента, що стимулює секрецію. В останньому випадку клітини преінкубіровалі в 4-форбол 12-міристат 13-ацетатом, узятим в концентрації 20 мг / мл при 37 ° С протягом 10 хв., Потім активовані і покояться нейтрофіли піддавали процедурі иммунопреципитации.

3.4.4. іммунопреціпітація

В експериментах по иммунопреципитации покояться і активовані нейтрофіли (10 7 кліток) ціалізуватися в 500 мкл лізісного буфера (20 мМ Т рис - НСl, рН 7,2, 100 мМ КСl, 0,9% Тритон Х-100, 10% гліцерин, 2 мМ ФМСФ). Лізати піддавали центрифугированию при 18000 д (20 хв; 4С) і відбирали супернатант. Супернатанти (в складі яких є різні SNARE комплекси) піддавали иммунопреципитации. Антитіла проти VAMP-1, SNAP-25, SNAP-23 сорбировали на протеїн А-агарозе (10-20 мкг антитіл на 100 мкл 20 -% - ой протеїн А-агарози) 2 години при 4 С. отримання Афінами сорбент відмивали від незв'язаних антитіл лізісним буфером, після чого інкубували з лізатів нейтрофілів протягом носи при 4С. Після закінчення інкубації агарозу облягали і 3 рази промивали лізісним буфером, після чого додавали 30 мкл буфера для приготування зразків для електрофорезу (62,5 мМ Т рис --НСl, рН 6,8, 100 мМ дітіотрейтол, 2% SDS, 10% гліцерин і 0,1%, бромфеноловий синій) 5 і иммуноблотинга з використанням антитіл проти сінтаксін 6, а також VAMP-1, SNAP-25 і SNAP-23 (для контролю зв'язування АТ носія з відповідними компонентами SNARE комплексів).

4. Отримані результати та їх обговорення

Завдання цього дослідження полягала в дослідженні особливостей функціонування білка сінтаксін 6 в екзоцитозу внутрішньоклітинних гранул нейтрофілів людини. До теперішнього часу білок сінтаксін 6 ідентифікований в нейтрофілах. Встановлено, що сінтаксін 6 присутній в плазматичній мембрані клітин. Так в покояться нейтрофілах білок рівномірно розподілений по всій поверхні клітини, в той час як в нейтрофілах, підданих стимуляції, відбувається перерозподіл сінтаксін 6 і накопичення білка в зонах інтенсивної дегрануляції. Сінтаксін 6 взаємодіє з іншими SNARE in vitro. Раніше Равінчандраном з співавторами було виявлено, що сінтаксін 6 здатний до взаємодії з двома изоформами SNAP-23 (SNAP-23A і SNAP-23B) 43. Сукупність цих даних дозволила зробити висновок, що сінтаксін 6, ймовірно бере участь в екзоцитозу гранул в якості t-SNARE . Відомо, що нейтрофіли людини містять чотири типи гранул: азурофільние, специфічні, секреторні і желатіназние гранули, які в різній мірі здатні зазнавати екзоцитоз. В даний час в нейтрофілах людини виявлені множинні ізоформи ключових білків SNARE комплексу: два білки сімейства VAMP (VAMP-1 і VAMP-2), два білка сімейства SNAP-25 (SNAP-25 і SNAP-23), і широкий набір білків сімейства сінтаксіонов , а саме сінтаксін 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9,11 та 16. Отже, цілком можливо, що множинні ізоформи v- і t-SNARE потрібні для забезпечення необхідної селективності при злитті мембран в нейтрофілах. Таким чином, ми припустили, що в клітці при активації екзоцитозу певного типу гранул формуються строго певні SNARE комплекси. Ми спробували виявити і охарактеризувати сінтаксін 6 - містять SNARE комплекси. Для вирішення цього завдання був використаний експериментальний підхід, заснований на виділенні з нейтрофілів людини SNARE комплексів за допомогою иммунопреципитации на моноспеціфіческіх антитіла, приєднаних до протеїн А-агарозе і подальшому імунохімічної аналізі білкового складу цих комплексів. Виділення SNARE комплексів здійснювали з покояться і активованих клітин. Виділення нейтрофілів проводили зі свіжої периферичної крові людини за допомогою седиментації еритроцитів, центрифугування на Ficol / Hipaque і подальшого гіпотетичного лізису домішкових еритроцитів. Виділені клітини активували з метою екзоцитозу внутрішньоклітинних гранул. Відомо, що нейтрофіли можуть перебувати як в спочиваючому так і в активованому стані 8. При активації різко збільшуються основні функції нейтрофілів: захисні і запальні, за рахунок дегрануляції внутрішньоклітинних гранул 1, а значить і здатність до утворення SNARE комплексів 45. Нейтрофіли активували до екзоцитозу при допомоги 4-форбол 12-міристат 13-ацетату (ФМА) в концентрації 20 мг / мл. З літературних джерел відомо про існування великої кількості активаторів нейтрофілів, в тому числі і активаторів секреції. Так, зокрема, секрецію можна індукувати шляхом впливу на клітину форболових ефірів, хемотаксичних пептидів (типу форміл-метіоніл-лейцил-фенілаланіну, FMLP), імунних комплексів антиген / антитіло і т.д. Причому, серед цих сполук виявляються індуктори здатні викликати екзоцитоз гранул тільки певного типу. Так, наприклад, (FMLP) хемотаксичний пептид в концентрації 10 -7 М, при якій індукується екзоцитоз гранул. Відомо, що активація нейтрофілів хемоаттрактантамі супроводжується хемотаксинами і змінами форми клітин; клітини при цьому стають асиметричними витягнутими, набувають відростки, а лідируючий край клітини формує зону, залучену в дегрануляцію 5. У даній роботі ми використовували форболмірістатацетат (ФМА), так як він є індуктором екзоцитозу желатіназних і специфічних гранул. А так як відомо, що VAMP-1; VAMP-2 і SNAP-25, SNAP-23 локалізовані в мембранах желатіназних / специфічних гранул 8, тому був застосований саме ФМА. Активацію проводили 10 хвилин при 37 ° С при кінцевій концентрації індуктора 20 мг / мл, тому що в цих умовах екзоцитоз відбувається повністю. В якості контролю браліклеточную суспензію, витриману в спокої при + 4С, 10 хв. Потім активовані і покояться нейтрофіли піддавали процедурі иммунопреципитации. За допомогою иммунопреципитации, ми досліджували взаємодії білків сінтаксін 6 з VAMP-1, SNAP-25, SNAP-23. Для вивчення взаємодії сінтаксін 6 з білком VAMP-1 було здійснено осадження на моноспеціфіческіх поліклональних, кролячих антитіл проти VAMP-1 (Synaptyc Systems, Німеччина). Ці тіла мають високу специфічність а розпізнаванні VAMP-1. Потім VAMP-1 іммунопріціпітати піддавали електрофорезу в присутності ДДС-Na для розділення білків в поліакриламідному гелі за їх молекулярній масі і подальшого імуноблотинг із застосуванням моноспеціфіческіх моноклональних антитіл, проти сінтаксін 6. Результати иммуноблотинга показані на рис.4.1. Видно, що в VAMP-1-іммунопреціпітата виявляється сінтаксін 6. Таким чином, ми зробили висновок що сінтаксін 6 (білок плазматичноїмембрани, t-SNARE), здатний in vivo до зв'язування з мембранним білком секреторних гранул VAMP-1, v-SNARE. Порівняльний аналіз іммунопреціпітата з покояться і активованих форболмірістатацетатом клітин показав, що вміст сінтаксін 6 в іммунопреціпітата з активованих клітин значно вище, ніж з покояться нейтрофілів. Таким чином, бінарні взаємодії сінтаксін 6 / VAMP-1, мабуть, реалізуються при екзоцитозу популяції желатіназних і специфічних гранул нейтрофілів людини. Дотримуючись схемою стратегії ми досліджували взаємодію сінтаксін 6 з SNAP-25 і SNAP-23 білками секреторних гранул нейтрофілів. Для цього ми використовували мноспеціфіческіе, моноклональні антитіла проти білка SNAP-23 (SMI 81, Sternberger Monoclonals Inc., США) і поліклональні антитіла проти SNAP-23. З літературних даних відомо, що в нейтрофілах людини, де присутні дві ізоформи SNAP-23 (SNAP-23A і SNAP-23B), сінтаксін 6 взаємодіє з обома изоформами 43 in vitro. За допомогою іммунопріціпітаціі на моноспеціфіческіх антитіла приєднаних до протеїн А-агарозе, ми досліджували взаємодії білків сінтаксін 6 з SNAP-23 і SNAP-25. Потім іммунопріціпітанти піддавали електрофорезу. Результати електрофорезу показані на рис.4.2 і рис.4.3. Наші дані свідчать, що взаємодії сінтаксін 6 з білками сімейства SNAP-25 відбуваються і in vivo, тобто інтактних клітинах.

42

Рис.4.1. Імунодетекції сінтаксін 6 в VAMP-1 іммунопріціпітатах з нейтрофіла людини. Рівні кількості іммунопріціпітатов були піддані поділу в 12% -му ПААГ і иммуноблотинга з використанням антитіл проти сінтаксін 6.

К - екстракт з мозку щура (3 мкг білка).

П - клітини не піддані активації (спокій).

А - активовані ФМА клітини.

42

Рис.4.2. Імунодетекції сінтаксін 6 в SNAP-25 іммунопріціпітатах з нейтрофіла людини. Рівні кількості іммунопріціпітатов були піддані поділу в 12% -му ПААГ і иммуноблотинга з використанням антитіл проти сінтаксін 6.

К - екстракт з мозку щура (3 мкг білка).

П - клітини не піддані активації (спокій).

А - активовані ФМА клітини.

Сукупність отриманих експериментальних даних дозволяє зробити висновок, що екзоцитоз специфічних / желатіназних гранул, мабуть, супроводжується утворенням SNARE комплексів, до складу яких входять сінтаксін 6 / SNAP-25 / VAMP-1 або сінтаксін 6 / SNAP-23 / VAMP-1.

42

Рис.4.3. Імунодетекції сінтаксін 6 в SNAP-23 іммунопріціпітатах з нейтрофіла людини. Рівні кількості іммунопріціпітатов були піддані поділу в 12% -му ПААГ і иммуноблотинга з використанням антитіл проти сінтаксін 6.

К - екстракт з мозку щура (3 мкг білка).

П - клітини не піддані активації (спокій).

А - активовані ФМА клітини.

висновки

За допомогою иммунопреципитации вивчені взаємодії білка плазматичноїмембрани. Сінтаксін 6, з окремими представниками білків групи SNARE in vitro. Сінтаксін 6 взаємодіє з білками мембран гранул VAMP-1 і двома білками сімейства SNAP-25 (SNAP-23 і SNAP-25).

На підставі літературних даних і результатів власних досліджень запропонована схема, яка пояснює екзоцитоз специфічних гранул нейтрофілів людини через освіту тримерного SNARE комплексів - VAMP-1 / сінтаксін 6 / SNAP-25 і VAMP-1 / сінтаксін 6 / SNAP-23.

Список використаної літератури

1. Бєлова Л.А. Біохімія процесів запалення і ураження судин. Роль нейтрофілів // Біохімія. - 1997. - Т.62. - С. 659-668.

2. Глєбов Р.Н. Ендоцитоз і екзоцитоз // Біохімія мембран. - М .: Вища школа, 1987. - 95 с.

3. Маянский А.І., Маянский Д.Н. Нариси про нейтрофілів і макрофаги. - Новосибірськ, 1983.

4. Набокіна С.М., Моллінедо В. Внутрішньоклітинна локалізація VAMP-1 в нейтрофілах людини // Тези доповідей, 1998. - С. 82.

5. Набокіна С.М. Регуляція екзоцитозу в нейтрофілах людини: Автореф .: дис ... докт.біол.наук: 03.00.25. - М., 1999. - 33 с.

6. Оглобліна О.Г. Питання медичної хімії. - М., 1988. - С. 2-9.

7. Хорст А. Молекулярні основи патагенеза хвороб. - М .: Медицина, 1982.

8. Чижевський А.А. Біофізичні механізми осідання еритроцитів. - Новосибірськ, 1987. - С. 39-43.

9. Barnard RJ, Morgan A., Burgoyne RD Stimulation of NSF ATPase activiny by alhpa - SNAP is required for SNARE complex disassembly and exocytosis // J. Cell Bid. - 1997. - V.139. - P. 875-883.

10. Baumert M., Maycox PR, Navone F., Decamilli P., Jahn R. Synaptobrevin: an integral membrane protein of 18,000 daltons present in small synaptic vesicles of rat brain // EMBOJ. 1989. - V.8. - P. 379-384.

11. Bennett MK, Calakos N., Sheller RH Syntaxin: a synaptic protein implicated in docking of synaptic at presynaptic active zones // Science. - 1992. - V. 257. - P. 255-259.

12. Bennett MK, Garcia-Arraras JE, Elferink LA, Peterson K., Fleming AM, Hazuka CD, Scheller RH The syntaxin family of vesicular transport receptors // Cell-+1993. - V. 74. - P. 863-873.

13. Bock JB, Lin RC, Scheller RH A new syntaxin family member implicated in targeting of intracellular transport vesicles // J. Biol. Chem - 1996. - V.271. - P. 17961-17965.

14. Bock JB, Scheller RH A fusion of new ideas // Nature. - 1997. - V.387. - P. 133-135.

15. Brennward P., Kearns B., Champion K., Keranen S., Bankaitis V., Novick P. Sec 9 is a SNAP-25-like component of a yeast SNARE complex that may be the offector of Sec 4 function in exocytosis // Cell. - 1994. - V.79. - P.245-258.

16. Brumell JH, Volchuk A., Sengelov H., Borregaard N., Cieutat A.-M., Baiton DF, Grinstein S., Klip A. Subcellural distribution of docking / fusion proteins in neutrophils, secretory cells with multiple exocytic compartments // J. Immund. - 1995. - V.155. - P.5750-5759.

17. Galakos N., Bennett MK, Peterson KE, Scheller RH Protein-protein interactions contributing to the specificity of intracellular vesicular trafficing // Science. - 1994. - V.263. - P.1146-1149.

18. Calhoun BC, Goldenring JR Two Rab proteins, vesicle-associated membrane protein 2 (VAMP-2) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs), are present on immunoisolated parietal cell tubulovesicles // Biochem. J. - 1997. - V.325. - P.559-564.

19. Cheatham B., Volchuk A., Kahn CR, Wang L., Rhodes CJ, Klip A. Insulinstimulated translocation of GLUT 4 glucose transporters requires SNARE-complex proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1996. - V.93. - P15169-15173.

20. Chin AC, Burgess RW, Wong BR, Schwarz TL, Scheller RH Differential expression of transcripts from syb, a Drosophila melanogaster gene encoding VAMP (synaptobrevin) that is abundant in non - neuronal cells // Gene. - 1993. - V.131. - P.175-181.

21. Conner S., Leaf D., Wessel G. Members of the Snare hypothesis are associated with cortical granule exocytosis in the sea urchin egg // Mol. Reprod. Dev. - 1997. - V.48. - P.106-118.

22. Edwardson JM A cell-free system Ca 2+ -regulated exocytosis // Methods. - 1998. - V.16. - P. 209-214.

23. Fasshauer D., Eliason WK, Brunger AI, Jahn R. Identification of a minimal core of the synaptic SNARE complex sufficient for reversible assembly and disassembly // Biochemistry. - 1998. - V.37. - P.10354-10362.

24. Ferro-Novick S., Jahn R., Vesicle fusion from yeast to man // Nature. - 1994. - V.370. - P.191-193.

25. Fujita H., Tuma PL, Finnegan CM, Locco L., Hubbard AL Endogenous syntaxins 2, 3 and 4 exibit but overlapping patterns of expression at the hepatocyte plasma membrane // Biochem. J. - 1998. - V.329. - P. 527-538.

26. Gaisano HV, Sheu L., Grondin G., Ghai M., Bouquillon A., Lowe A., Beaudoin A., Trimble WS The vesicle-associated membrane protein family of proteins in rat pancreatic and parotid acinar cells // Gastroenterology . - 1996. - V.111. - P. 1661-1669.

27. Hess DT, Slater TM, Wilson MC, Skene JHP The 25 kDa synaptosomal-associated protein SNAP-25 is the major methionine-rich polyleltide in rapid exonal transport and a major substrate for palmiloylation in adult CNS // J. Neurosci. - 1992. - V.12. - P.4634-4641.

28. Ikebuchi Y., Masumoto N., Matsuoka T., Yokoi T., Tahara M., Tasaka K., Miyake A. SNAP-25 is essential for cortical granule exocytosis in mouse eggs // Am. J. Physiol. - 1998. - V.274. - P.1496-1500.

29. Isemann S., Knew-Goodall Y., Gamble J., Vadas M., Wattenberg BW A splice-isoform of vesicle-associated membrane protein-1 (VAMP-1) contains a mitochondrial targeting signal // Mol. Biol. Cell. - 1998. - V.9. - P.1649-1660.

30. Jacobsson G., Pichl F., Meuster B. VAMP-1 and VANP-2 gene expression in rat spinal motoneuruns: differential regulation after neuronal injury // Eur. J. Neurosci: - 1998. - V.10. - P.301-316.

31. Jagadish MN, Fernandec CS, Hewich DR, Macaulay SL, Gough KH, Grusovin J., Verkuylen A., Cosgrove L., Alafaci A. Insulin-responsive tissues contain the core complex protein SNAP-25 (synaptosomal-associated protein 25 ) A and B isoforms in addition to syntaxin 4 and synaptobrevins 1 and 2 // Biochem. J. - 1996. - V.317. - P.945-954.

32. Klumperman J., Kuliawt R., Criffith JM, Geuze HJ Mannose G-phosphate receptors are sorted from immature secretory granules via adaptor protein AP-1, clathrin, and syntaxin 6-positive vesicles // J. Cell Biol. - 1998. - V.141. - P.359-371.

33. Kretzschman S., Volknandt W., Zimmermann H. Colocalization on the same synaptic vesicles of syntaxin and SNAP-25 with synaptic vesicle proteins: A reevaluation of functional models required? // Neurisci. Res. - 1996. - V.26. - P.141-148.

34. Masaki R., Yamamoto A. Important roles of the C-terminal portion of HPC-1 / syntaxin 1A in membrane anchoring and intracellular localization // J. Biochem. (Tokyo). - 1998. - V.124. - P.311-318.

35. McMahon HT, Usharyov YA Cellubrevin is a ubiguitous vesicle fusion protein // Nature. - 1993. - V.364. - P.346-349.

36. Misonou H., Kumaruka K. Regulation of the priming of exocytosis and the dissociation of SNAP-25 and VAMP-2 in adrenal chromaffin cells // Neurosci. Lett. - 1997. - V.232. - P.182-184.

37. Mollinedo F., Lazo PA, Identification of two isoforms of the vesicle-membrane fusion protein SNAP-23 in human neutrophils and HL-60 cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1997. - V.231. - P.808-812.

38. Mollinedo F., Naranjo JR Uncuopled changes in the expression of the jun family members during myeloid cell differentiation // Eur. J. Biochem. - 1991. - V.200. - P.483-486.

39. Niemann H., Blasi J. Clostridial neurotoxins: new tools for dissecting exocytosis // Trends Cell Biol. - 1994. - V.4. - P.179-185.

40. Pevcner J., Calacos N., Ting AE Specificity and regulation of a synaptic vesicle docking complex // Neuron. - 1994. - V.13. - P.353-361.

41. Poirier MA, Xiao. The synaptic SNARE complex is a parallel four-stranded helical bundle // Nat. Struet. Biol. - 1998. - V.5. - P.765-769.

42. Protopopov V., Gerst J. Homologs of the synaptobrevin VAMP family of the synaptic vesicle proteins function on the late secretory pathway in S. cerevisial // Cell. - 1993. - V.74. - P.855-861.

43. Ravichandran V. Identification of a novel syntaxin - and synaptobrevin / VAMP-binding protein, SNAP-23, expressed in non-neuronal tissues // J. Biol. Chem. - 1996. - V.271.

44. Rothman JE Mechanisms of intracellular protein transport // Nature. - 1994. - V.372. - P.55-63.

45. Schiavo G., Stenbeck G. Binding of the synaptic vesicle v-SNARE, synaptotagmin, to the plasma membrane t-SNARE, SNAP-25, can explain docked vesicles at neurotoxin-treated synapses // Proc.Natl.Acad. Biol. Chem. - 1998. - V.273.

46. ​​Shiff G., Morel N. Association of syntaxin with SNAP-25 and VAMP (synaptobrevin) during axonal traonsport // J. Neurosci. Res. - 1997. - V.48.

47. Sollner T., Whiteheart SW SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion // Nature. - 1993. - V.362. - P.318-324.

48. Whiteheart SW, Griff C., Clary DO SNAP family of NSF attachment proteins includes a brain-specific isoform // Nature. - 1993. - V.362. - P.353-355.

...........


  • Вивчення взаємодії сінтаксін 6 з мембранними білками секреторних гранул нейтрофілів людини
  • Перелік ключових слів
  • Мета роботи
  • Отримані результати
  • 1. Огляд літератури
  • 1.2. Внутрішньоклітинні гранули нейтрофілів людини
  • 1.3. Сучасні уявлення про механізми злипання / злиття мембран
  • 2. Характеристика основних білкових компонентів моделі
  • 2.6. Механізм злипання / злиття мембран
  • 3. Методи
  • 3.2. Виділення нейтрофілів людини
  • 3.3. електрофорез білків
  • 3.4.1. Перенесення фракцій з гелю на фільтр
  • 3.4.2. Імунне виявлення антигенів на фільтрі
  • 3.4.3. Активація нейтрофілів
  • 3.4.4. іммунопреціпітація
  • 4. Отримані результати та їх обговорення
  • Список використаної літератури

  • Скачати 66.55 Kb.