Вірусній Гипатія З






    Головна сторінка





Скачати 89.07 Kb.
Дата конвертації06.06.2017
Розмір89.07 Kb.
Типкурсова робота

10

Вступ

Вірусні гепатити займають Одне з дере Місць в інфекційній патології людини, после грипу и респіраторніх вірусніх захворювань.

За життя без велічіні соціально-економічного збитків та медічній значімості вірусні гепатити займають ведучого місце в інфекційній патології України та других стран. Щорічно число захворіліх Гостра віруснімі гепатитами досягає більш миллиона чоловік.

Вірусні гепатити В, С і D - найбільш важкі форми гепатітів, что ведуть до хронізації з Наступний Формування цироз печінкі, первинного раку печінкі и часто приводять до летальних результатів. Так за данімі ВООЗ (1995 рік) хронізація при вірусному гепатіті В складає 10%, при вірусному гепатіті З 70%, при вірусному гепатіті D - 10-15%. Летальність при вірусному гепатіті А складає 0,6%, при вірусному гепатіті В - 1,4%, С - 1-2%, D - 30%.

Близько 3% СВІТОВОГО населення (более 170 млн. Чоловік) виявило інфікованих вірусом гепатиту С (ВГС), з якіх у 90% Симптоми відсутні Взагалі. Фактично, більшість людей, не знали про ті, что смороду хворіють, Доті, поки медичні аналізи НЕ виявляв їх десятки років, протягом якіх їхня печінка Повільно руйнувалася. Іноді люди могли дізнаватіся про ті, что Хворі на гепатит С, при спробі стати донором крови, тому, что в банках крови заведено перевіряті ее на віруси.

У багатьох випадка, ВГС приводити до хронічніх захворювань печінкі, таким, як цироз, рак печінкі чи печінкової недостатності. І займає друге місце в Ураження печінкі, уступаючі лишь алкоголізму и є вагомий підставою для пересадження печінкі. Хоча проти гепатітів А і В Використовують вакцини, які не існує вакцини проти гепатиту С. Вакцина проти вірусу гепатиту С дотепер НЕ розроблено. Основними проблемами на шляху розробки вакцини є наявність гіперваріабельніх ділянок у геномі ВГС, висока частота мутацій вірусу и Слабкий гуморального відповідь на вакцину.

Если Ранее, до 1993 - 1994 р.р., причиною Поширення парентеральних форм передачі вірусної інфекції були медичні маніпуляції, то останнім часом усе більшу пітому Вагу в прічіні їхнього Поширення займає наркоманія (парентеральне! Застосування наркотіків), унаслідок чого в найбліжчі роки Варто очікуваті Значний підйом захворюваності віруснімі гепатитами среди населення України.

Прогрес у діагностіці вірусніх гепатітів ставши можливіть Завдяк успіхам молекулярної біології и генної інженерії в області вірусології. Нові технології: імуноферментній, радіоімунологічні методи и ланцюгова полімеразна Реакція міцно ввійшлі в практичності вірусологію. Широке Впровадження маркерної діагностики дозволило вірішуваті питання як КЛІНІЧНОЇ діагностики, так и много епідеміологічніх аспектів ціх інфекцій.

Звичайне лікування для ВГС НЕ є універсально ефективного, так что поиск Нових лікарськіх ЗАСОБІВ на сьогоднішній день є актуальним харчування.

Тому, метою даної роботи Було Вивчення ефектівності! Застосування імуномодуляторів при лікуванні гепатиту С.

До завдань дослідження входило:

Вивчення іменних показніків при ВГС

Визначення іменних показніків при лікуванні Хворов на ВГС циклофероном.

Вивчення ефектівності! Застосування аміксіна при лікуванні ВГС.

Порівняння ефектівності! Застосування обох препаратів при ВГС.

1. Огляд літератури

1.1 Класифікація вірусу гепатиту С

ВГС єдиний член роду Hepacіvіrus у сімействі Flavіvіrіdae, у Пожалуйста входять Такі віруси, як вірус діареї Биків и лихоманки свиней (рід Pestіvіrus) и вірус жовтої лихоманки, вірус денге и GB-віруси: GBV-A, GBV-B и GBV-C / HGV (рід Flavіvіrus).

Під словами "вірус гепатиту С" мається на увазі гетерогенна група вірусів, що містять РНК. Їхня класифікація засновано на генетічній подібності. Найбільш Визнана номенклатура [Simor, 1992] розрізняє шістьох основних генетичних груп и ряд віділеніх підтіпів, что ма ють найбільшу подібність. Типи нумеруються, починаючі з одиниці, а підтіпам прівласнюють букви a, b і с у відповідності з роком Відкриття.

У 1990 году в Хюстоні Було показано, что гепатит С - один Із шести найбільше часто ідентіфікуючіх гепатовірусів - іншімі є A, B, D, E, G. Усі випадки запаленою печінкі приводять до Порушення функцій печінкі. Гепатит С Звичайно розглядається як найбільш небезпечний среди ціх вірусів [Кузин, 1999].

1.2 Будова вірусу гепатиту С

Нуклеокапсид містіть РНК вірусу гепатиту С. зверху нуклеокапсид покриттів ліпідною оболонками з утоплення в ній оболонковімі білкамі, кодованому РНК ВГС. Геном вірусу уявлень одноланцюговою лінійною молекулою РНК позітівної полярності, довжина около 9600 нуклеотидів. Організація геному ВГС подібна іншім флавівірусам. в ньом віділяють две зони, Які кодують структурні и неструктурні (функціональні) Білки.

Гени, что кодують структурні Білки, розташовані в 5 області геному вірусу, а неструктурні в 3 області. Геном ВГС має одну відкріту рамку зчітування (ВРЗ), єдиний поліпептід (примерно в 3000 амінокіслот), что під дією вірусніх и клітінніх протеаз нарізується на структурні и неструктурні Білки. [Роззяв, 1998]

До структурних білок відносять Білки, кодовані Core, El и Е2 (р21) з молекулярною масою - 21 k, усічена (Р19) и форма (р16), Виявля в ядерцях інфікованих гепатоцитів. На життя без поверхні С-білок Несе Різні вісококонсерватівні В-клітінні епітопі, Існування якіх Надзвичайно важліво для Виявлення Антитіл до ВГС у процесі лабораторної діагностики гепатиту С [Laverdant, 1989].

Зони РНК ВГС - Е1 и Е2 кодують Білки з молекулярної масою 31 и 70 k. ЦІ Білки ма ють кілька ділянок N-глікозілювання; в Е1 білку визначили до 6 таких ділянок, а в Е2 - 11. У ділянці Е2 уклад інформація про Невеликий білок - р7, что у структурі вірусу НЕ Виявлення.

Позначення регіонів, розташованіх Ближче до 3 кінцю РНК ВГС - як зон, что несуть інформацію про неструктурні Білки вірусу, указує на ті, что ЦІ Білки НЕ є структурними компонентами вірусної Частки. У неструктурній зоне РНК ВГС віділяють ділянки, позначені як: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Більшість з білків, кодованому неструктурними зонами РНК ВГС, необхідні для реплікації вірусу.

Порівняльній аналіз нуклеотидних послідовностей РНК ізолятів ВГС, отриманий у різніх регіонах світу и даже у процесі захворювання від того самого пацієнта, виявило основнову особлівість цього вірусу - скроню гетерогенність РНК. Положення про значної генетичний варіабельності РНК ВГС стало в основу Теорії, что пояснюють: трівале (іноді довічне) носійство вірусу, частий розвиток хронічного захворювання, Труднощі в терапії и створенні ефективних вакцин препаратів. Найбільш значні Відмінності послідовностей РНК ВГС зосереджені в N-кінцевій части регіону Е2, что позначають - "гіперваріабельній регіон" (HVR).

У Сейчас годину визначили 6 основних генотіпів и понад 100 субтіпів ВГС. Генотип 1а, 1в, 2а, 2в, 2з и За складають більш 90% ВГС - ізолятів, отриманий у Північній и Південній Амеріці, Европе, России, Китаї, Японії й Австралии / Нової Зеландії. Генотип 4, 5а и 6 відповідно реєструються в Центральній и Південній Афріці, Південно-Східній азії. В России и странах СНД зареєстрована перевага генотипу 16 (НЕ Менш 68,9%). Вважається, что пацієнті, інфіковані генотипом 1 (особливо 1в), відповідають гірше на лікування в порівнянні з пацієнтамі, інфікованими іншімі генотипами вірусу [Yuasa, 1991].

У хворого ВГС ціркулює як популяція часток вірусу, у якіх геном відрізняються один від одного на 1-2% (квазіспеціфічності) у результате мутацій, что накопічуються во время інфекції чи, что попали в організм пацієнта при зараженні. ЦІ мутантні форми могут Сприяти більш актівної чи реплікації могут допомагаті вірусу ухілятіся від імунної ВІДПОВІДІ організму и потенційно впліваті на результат гострої інфекції, розходження в пліні захворювання и ВІДПОВІДІ на інтерферонотерапію [Жданов, 1986].

1.3 Життєвий цикл

Життєвий цикл ВГС Включає Утворення реплікатівніх (негативних -) ланцюгів РНК, что службовців матрицею для Утворення геномних молекул. Частота Виявлення реплікатівной форми РНК ВГС за данімі одних дослідніків складає 35% віпадків [Абдулмеджідова, 2000], тоді як за данімі інші до 100% [Chang, 2000]. Істотна розбіжність Даних может порозуміватіся труднощямі, что вінікають при візначенні негатівної-РНК, тому что Кількість негативних ланцюгів РНК на один [lanford, 1995] - три [Mellor, 1998] порядку нижчих, чем позитивна + РНК. Це порозумівається тім, что одна молекула РНК может служити матрицею для синтезу декількох геномних молекул [Маслова, 2000].

Серед дослідніків немає єдиної думки про ТІМ, Наскільки реплікація вірусу звязана з процесами пошкодженню печінкі и виходом вірусніх часток у периферичної кров [De Molіner, 1998. Marcus, 1994]. За данімі Marcus з співавт. [1998, 1999], что вікорістовувалі напівкількісній метод ПЛР, немає строгого звязку между вірусною реплікацією и рівнем віремії. Согласно отриманий нами данім, реплікація вірусу в печінці супроводжується більшою частотою Виявлення РНК ВГС у сіроватці крови, однак достовірної кореляції между цімі параметрами не виявлено. Невідповідність между кількістю Виявлення геномної и реплікатівної форм РНК ВГС у печінці и рівнем віремії может буті наслідком ряду причин:

1 - елімінації вірусу Із Сироватко с помощью спеціфічніх Антитіл;

2 - надходження ВГС у периферичної крові не только з печінкі, но и з других ОРГАНІВ и тканин;

3 - Порушення процесса вівільнення вірусу з кліток печінкі під дією лікарськіх чи ЗАСОБІВ других факторів [Marcus, 1994].

Досвіді, проведені в Нашій лабораторії, що не виявило достовірної кореляції между частотою зустрічаємості негативна-РНК ВГС у печінці І ступеня поразка печіночної тканини [Лакіна, 2000]. Це Погода з припущені, что вірус может реплицироваться, що не віклікаючі серйозно пошкодженню у тканіні печінкі. Однако є дані про можливий доля вірусної реплікації в розвитку цітопатічного ЕФЕКТ [Chang, 2000., Tsutsumі, 1994]. С помощью методу гібрідізації іn sіtu показано, что кліткі, що містять репликативную форму РНК вірусу, локалізовані в основном у вогнище поразка печінкі [Tsutsumі, 1994]. Виявлено достовірну кореляцію между кількістю гепатоцитів.

1.4 Епідеміологія и клініка

Джерелом інфекції є только людина. Поширення вірусу відбувається трансфузіонно при переліванні крови и ее чи препаратів інструментальнім Шляхом у результате занесення зараженої вірусом крови в організм здорових людей, а такоже вертикально - від матері до плоду. Спрійнятлівість населення до ВГС дуже високого. За данімі ВООЗ на 1997 рік, на частко гепатиту С в Афріці припадати до 25% усіх віпадків вірусного гепатиту. У ряді стран Америки - до 35%. У США - до 90% посттрансфузійного вірусного гепатиту віклікається вірусом гепатиту С. Підтрімці епідеміологічного процесса спріяє Схильність гепатиту С до хронічному Пліній. Вірус віділяється від Хворов в течение однієї чи декількох тіжнів до з'явиться ознака хвороби и до 10 тіжнів после качана хвороби. Інкубаційній период у порівнянні з гепатитом B, Коротше примерно на 1 місяць и складає 6-8 тіжнів. Нерідке захворювання протікає без жовтяніці; остання спостерігається примерно в 25% хвороб. Незважаючі на відносно сприятливі плин, около 50% усіх форм інфекції приводять до формирование хронічного гепатиту, а около 20% хронічніх поразок печінкі закінчуються цироз и раком [Коротяев, 2000].

Вірус гепатиту С - це найбільш часта причина Гостра вірусніх гепатітів у людей похилого віку.Серед усіх вірусніх гепатітів, что уражалі людей похилого віку в США, Ізраїлі и Франции, гепатит у спостерігався в 74%, 72% и 60% віпадків, відповідно. Головного фактором ризики зараження гепатитом С у людей похилого віку є проведені Ранее гемотрансфузії.

Гепатит C - інфекція, віклікана вірусом гепатиту С; у клінічно вираженій випадка характерізується симптомами гострої поразка печінкі, что найчастіше протікає з помірною інтоксікацією й у більшості віпадків закінчується розвитку хронічного гепатиту С можливий переходом у цироз и первинний рак печінкі. Ранее Гепатит С позначали терміном "Гепатит НІ-А-НІ-В [Sonnenblick, 1990].

Однієї з основних характеристик гепатиту С є часта хронізація. Вважається, что 60-70% Гостра гепатиту С закінчуються розвитку хронічного гепатиту. Перехід Гостра гепатиту С в хронічній відбувається поступово. В течение декількох років наростає Активність патологічного процесса и фіброзу печінкі. Показники актівності сіроватковіх трансаміназ у межах чи норми незначна підвіщені. Показники сінтетічної Функції печінкі (Кількість Загальна Білка й альбуміну) у межах норми, аж до розвитку цироз печінкі. До факторів, что визначаються розвиток хронічного гепатиту, может буті віднесеній вік захворілого Гостра гепатитом С [Львів, 1997].

Для хронічного гепатиту С характерно наявність у печінці лімфоїдних інфільтратів; Існування пацієнтів Із ВГС-віреміей, но з нормальними Показники сіроватковіх трансаміназ, Які реєструються трівалій годину. Кроме цього, вісловлюється припущені, что в поразці печінкі может відіграваті роль підвіщеній рівень відкладення заліза в клітках печінкі [Шахгильдян, 1999].

Патоморфологічно гепатит С характерізується Загальна проявити запаленою и некрозу. Разом з тим, на Відміну Від гепатиту В чи А, а такоже гепатітів невірусної етіології, для гепатиту С, характерні Такі гістологічні ознака як: наявність у портальних трактах щільніх лімфоцитарних агрегатів и фолікулів; інтраваскулярні сінусоїдальні інфільтраті чи лімфоцитів гіперплазірованніх Купфферовскіх клітін при відсутності вираженість некрозу гепатоцитів у безпосереднім оточенні; зміненій епітелій жовчніх проток; жирова дістрофія. Разом з тим, необходимо враховуваті, что спектр пошкодженню печіночніх клітін при гепатіті З может буті Надзвичайно широкий [Кузин, 1999].

У більшості Хворов хронічнім гепатитом С в плин трівалого ПЕРІОДУ годині захворювання має безсимптомний перебіг. У 55-60% випадка реєструються печіночні прояви захворювання. До них відносять: незначна Збільшення печінкі, Підвищення актівності сіроватковіх трансаміназ (у 2-3 рази), что змінюються періодамі їхньої нормалізації. У период клінічно вираженій сімптомів захворювання хворий отмечает стомлюваність, млявість, нездужання, зниженя працездатності, поганий сон, почуття ваги в правому підреберї. У 40-45% віпадків реєструють внепечіночну проявити захворювання. Вважають доведенням, что змішана кріоглобулінемія асоційовано з хронічнім гепатитом С. Вона реєструється в 42-96% віпадків, а в 10-42% має КЛІНІЧНІ прояви: слабість, артралгія пурпуру, синдром Рейно, артеріальна гіпертонія, поразка бруньок. До складу кріопреціпітата могут входити РНК ВГС, антитіла до білок кодованому структурною и Неструктурні Частина геному ВГС. У якості других внепечіночніх проявів хронічної ВГС-інфекції розглядають: ендокрінні (гіпертіреоз, гіпотиреоз, тиреоїдит Хашимото); гематологічні (ідеопатічна тромбоцітопенія, неходжкінская В-лімфома, апластична анемія та ін.); поразка слінніх залоза и око (лімфоцітарній сіалоаденіт, віразкі роговіці, увеіт); шкірні (пізня шкірна Порфірія, червоний плоский лишай, вузлувата ерітема та ін.); нейромішечні и суглобні (міопатічній синдром, синдром Гійена-Барре й ін.); ніркові (гломерулонефрит); автоімунні (вузліковій періартерііт). У більшості віпадків внепечінкові прояви реєструються в пацієнтів, схільніх до аутоімунних реакцій. У Сейчас годину такоже Прийнято вважаті інфікування вірусом гепатиту С причиною розвитку гепатоклітіної карциноми [Львів, 1997].

Рідкім ускладненням Гостра гепатиту С є фульмінантній гепатит при ретроспективному дослідженнях нашли, что в Хворов фульмінантнім гепатитом у вік вищє 50 років є Незалежності прогностичність фактором [Hoofnagle, 1995].

Вірусній Гепатит С часто приводити до хронічного захворювання печінкі, и прінаймні в 50% Хворов розвівається хронічній гепатит. У тих, у кого вінікає хронічній гепатит, у 20 - 60% (дані залежався від трівалості спостереження) розвівається цироз печінкі [Покровський, 1993].

У Хворов хронічнім гепатитом С похилого віку титр РНК HCV значний вищє такого в молодих пацієнтів. Вірусом гепатиту С часто заражаються в старшому віці, тому в багатьох літніх людей спостерігається активна реплікація вірусу, при ТІМ что цироз печінкі Ще не встігає розвитися. Для порівняння: вірусом гепатиту В часто заражаються в дітінстві и юності, тому в людей похилого віку НЕ спостерігається актівної реплікації вірусу, а цироз до цього часу Вже розвівається. Знижена здатність імунної системи літніх має справити з вірусом гепатиту С пояснює більш скроню в порівнянні з молодими хворими віремію. Іншім можливий поясненням может служити тій факт, что люди похилого віку, як правило, уражаються ВГС типу 1Б, а в заражених вірусом такого типу спостерігається підвіщеній, у порівнянні з іншімі типами вірусу, рівень РНК ВГС у сіроватці. Ще одне можливе Пояснення Полягає в ТІМ, что в обстежуваніх Хворов віруснім гепатитом С похилого віку віявляється більш важка в порівнянні з молодими захворювання печінкі. А титр РНК ВГС збільшується з вагою хвороби печінкі [Кузин С.Н., 1999].

1.5 Лабораторна діагностика

При постановці діагнозу "гепатит С" та патенти враховуваті следующие найбільш Важливі фактори:

показатели актівності печінковіх ферментів;

наявність чи Відсутність маркерів інфікування вірусом гепатиту С (ВГС) и іншімі гепатотропними вірусамі;

дані епідеміологічного анамнезу;

результати клінічного обстежання пацієнта.

Тільки комплексний облік Даних факторів дозволяє з високим ступенів надійності діагностуваті це захворювання (Laverdant, 1989).

Це дает можлівість:

віявіті осіб з наявністю ВГС для зниженя уровня посттрансфузіонного гепатиту С;

постановка діагнозу и розмежування Гостра и хронічного гепатиту С;

прогноз захворювання;

призначення, оцінка и прогноз ефектівності проведеної терапії;

Вивчення широти Поширення ВГС у популяції и різніх групах населення.

Основою лабораторної діагностики гепатиту С є знання про ВГС, его реплікації, інформація про динамік з'явився и знікнення маркерів інфікування, а такоже сучасні імунохімічні и молекулярно-біологічні методи детекції антігенів, Антитіл и нуклеїнових кислот. (Yuasa, 1991)

ВИЗНАЧЕННЯ АНТИ-ВГС. У 1989 году група дослідніків фірми "Chіron Corporatіon" під керівніцтвом QL.Choo здійсніла клонування РНК ВГС и здобула імунореактівні олігопептіді, что вступають у реакцію з антітіламі, что ціркулюють у крови Хворов хронічнім гепатитом "ні А, ні В". ЦІ олігопептіді стали основою діагностичних препаратів для Виявлення Антитіл до ВГС (Лакіна, 2000)

КОНФОРМАЦІЙНІ ТЕСТИ. Для розмежування хибнопозитивних зразків и зразків, Дійсно утрімуючі антитіла до ВГС, розроблені додаткові (Supplemental) тести. Найбільше часто в ціх тестах вікорістовується принцип імуноблота, коли на нітроцеллюлозной мембрані адсорбуються у віді окремий смуг антигени, кодовані різнімі зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаємодіють з адсорбованімі антигенами с помощью міченіх ферментом Антитіл проти Іg людини з наступної їх детекціею с помощью субстратного комплексу (Prince, 1996).

ВИЗНАЧЕННЯ Іg АНТИ- ВГС. У Сейчас годину створені и промислово віпускаються діагностичні набори для Виявлення Іg анти-ВГС На етапі конструювання діагностичних наборів були створені набори для ІФА, основою якіх були пептиди, кодовані різнімі регіонамі РНК ВГС. Вибір БУВ зупинення на пептіді, кодованому Core регіоном РНК ВГС и віявленні Антитіл до него класу Іg (Ісаєва, 2001)

ВИЗНАЧЕННЯ АНТІГЕНІВ ВГС. Можлівість визначення антігенів ВГС прівертала Рамус дослідніків відразу ж после Відкриття вірусу. Принципова можлівість їхнього тестування булу продемонструвати К. Krawczynskі зі співавторамі, что імуногістохімічно нашли в печіночній тканіні антигени ВГС, довівші спеціфічність імунофлюоресцентного випромінювання. ! Застосування полі- и моноклональних Антитіл до різніх антігенів ВГС установило наявність ВГС core Ag, антігенів, кодованому NS3 и NS4 зонами РНК ВГС, у ядрі и цітоплазмі гепатоцитів, у 60-90% Хворов хронічнім ВГС.Однак подальші дослідження продемонструвалі, что антигени ВГС удається найти Менш чим у 5% печіночніх клітін (Букринская, 1996).

Установлені:

можлівість визначення Core Ag ВГС у сіроватці та плазмі крови;

спеціфічність Виявлення Core Ag ВГС;

наявність осіб з ціркулюючім антигеном у крови серонегативних по анти-ВГС;

Частина (90,3%) Виявлення Core Ag ВГС у Сироватко крови з наявністю анти-ВГС и РНК ВГС;

пряма кореляція между концентрацією РНК ВГС и Виявлення Core Ag ВГС;

Визначили, что Core Ag ВГС удається віявляті в 83% віпадків (n = 24) следующего дня после первого Виявлення РНК ВГС и Задовго (у Середньому 26 днів) до з'явиться анти-ВГС.

Метод Виявлення РНК ВГС. Сучасний етап лабораторної діагностики гепатиту С можна охарактерізуваті як етап качана широкого! Застосування молекулярно - біологічних методів Виявлення РНК ВГС. Переважно більшість методів Виявлення нуклеїнових кислот Було апробовано для Виявлення РНК ВГС. Принципам конструювання діагностичних препаратів и їхньому ЗАСТОСУВАННЯ для детекції вірусніх ДНК чи РНК присвячений значний Кількість літературних оглядів, опублікованіх як у вітчізняніх, так и закордон виданнях. Усі ЦІ методи можна розділіті на двох груп, в Основі якіх лежить! Застосування Принципів гібрідізації без ампліфікації обраної ділянки нуклеїнової кислоти та з їх ампліфікацією, что дозволяє значний підвіщіті здатність методу.

МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ Заснований на зєднанні міченіх гібрідізаціонніх зондів (генноінженерні чи Синтетичні молекулярні структури, що містять у Собі нуклеотідні послідовності, комплементарні обраних ділянкам РНК). Облік результатів здійснюють по інтенсівності сигналу, что Надходить від Мітки в складі комплексу, что утворівся.

При гепатіті З цею метод Виявлення РНК ВГС самперед знайшов! Застосування для ее ідентіфікації безпосередно в гепатоцитах, у тестах что позначаються - іn sіtu hіbіdіzatіon. Можлівість безпосередньої детекції РНК ВГС у тканіні дозволила найти ее в мононуклеарних клітках крови, клітках слінніх залоза и других тканин організму хворого на гепатит С (Моміналіев, 2000).

МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ, Який ЗАСТОСОВУВАЛІ ДЛЯ детекції РНК ВГС, дозволяє продемонструваті наявність негативних (реплікатівніх) ланцюгів РНК ВГС, что свідчіть про активну реплікацію вірусу.

Метод полімеразної ланцюгової Реакції - у Данії годину найбільш широко застосовуваного методичний прийом, что лежить в Основі практично всех молекулярно-біологічних методів детекції РНК ВГС. Причем, визначення РНК ВГС можливе як у якісному, так и кількісному варіанті, что особливо важліво для призначення, моніторингу й ОЦІНКИ ефектівності застосовуваної терапії.

Як основні варіанти методу можна віділіті:

полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР);

лігазну ланцюгову реакцію;

NASBA;

ТМА (Реакція транскріпційно-опосередкованої ампліфікації, Transcrіptіon-medіated amplіfіcatіon).У его основе лежить багатоциклового процес, что нагадує природну реплікацію нуклеїнової кислоти, причому КОЖЕН цикл складається з послідовніх етапів.

З досліджуваного матеріалу (сироватка, плазма крови, печінковій біоптат) віділяється РНК ВГС. З Огляду на ті, что нуклеїнова кислота ВГС представлена ​​РНК, а для ампліфікації необхідна молекула кДНК, с помощью ферменту - зворотної транскриптази, відбувається Утворення одноланцюговіх молекул кДНК ВГС. На Наступний етапі до візначеної ділянки шкірного з ланцюгів кДНК ВГС прієднуються т. З. праймери - Короткі олігонуклеотіді, комплементарні відомим нуклеотидним послідовностям. Порівняння первинної Структури 5UTR області геному різніх ізолятів ВГС виявило їхню незначна мінлівість (между генотипами, гомологія нуклеотидів - 92-98%, а у середіні генотипу 98-99%).

Далі, за помощью ферменту ДНК-залежної ДНК полімерази відбувається синтез Нових ділянок ДНК. У Сейчас годину як джерело цього ферменту найчастіше Використовують бактерії Thermophіlus termus (Tth-полімераза) чи Thermophіlus aquatіcus (Taq-полімераза). Володіючі термостабільністю в прісутності іонів марганцю и магнію, цею фермент может буті одночасно Використання для синтезу комплементарних одноланцюговіх молекул кДНК ВГС и ампліфікації обраних ділянок кДНК. На завершальній етапі одного циклу Реакції, с помощью ДНК полімерази відбувається синтез Нових ланцюгів комплементарних кДНК ВГС. Багаторазове повторення ціклів Реакції виробляти до Накопичення фрагментів кДНК ВГС, что можливо зареєструваті с помощью електрофорезу в поліакріламідному Гелі з Наступний візуальною детекцією чи Із ЗАСТОСУВАННЯ гібрідізації з олігонуклеотіднімі зондами, что збільшує чутлівість и спеціфічність застосовуваного діагностичних препаратів. ! Застосування праймерів, міченіх ферментами, дозволяє Проводити облік результатів ПЛР с помощью імуноферментного АНАЛІЗУ.

ЛІГАЗНА ланцюгова Реакція Виявлення РНК bг. (LCR).

Метод Заснований на здатності ферменту "ДНК-залежної ДНК-лігазі" зшіваті (лігуваті) розріві фосфодіефірного звязку в ДНК у прісутності АТФ и іонів Mg2 +. Так само як и при проведенні "класичної" ПЛР для Виявлення РНК ВГС, перший етап LCR - зворотна транскрипція з одержаним кДНК ВГС. Далі ДНК-лігаза Здійснює звязування двох пар праймерів (комплементарних 5 некодованій зоне РНК ВГС), что надалі ампліфікуються. Детекція продуктів ампліфікації LCR здійснюється за помощью обліку Реакції антітіло-антиген-антітіло. Кожний Із двох праймерів мітіться різнім гаптеном. Перший з них захоплюється антітіламі, адсорбованімі на мікрочастінках. После процедури промівання с помощью Другої парі Антитіл, міченіх флуоресцентною міткою, відбувається їхня виборча Взаємодія з гаптеном в ампліфікаційному продукті з Наступний проведення субстратної Реакції й обліком на флюоріметрі.

Чутлівість цього методу складає около 200 Копій РНК ВГС у мл, что дозволяє его використовуват для решение різніх клініко-діагностичних завдань.

NUCLEІC ACІDS SEAQUENCENCE AMPLІFІCATІON - NASBA - метод детекції РНК ВГС Заснований на одночасній Дії трьох ферментів: зворотної транскриптази вірусу мієлобластомі птахів, РНК-ази Н і РНК-полімерази Т7. На Відміну Від RT PCR на Першому етапі не проводиться зворотна транскрипція РНК ВГС. С помощью використаних ферментів вдається здобудуть більш 109 Копій ділянки кДНК ВГС в течение 90 хвилин. Можлівість проведення Реакції при невеликих температурах (+41 С) значний спрощує роботу и дозволяє відмовітіся від устаткування, что Забезпечує ціклічні Зміни високих температур. Облік результатів Реакції здійснюється за помощью електрохемілюмінісценції. Незважаючі на ті, что по життя без чутлівості NASBA Близько до RT PCR, метод широко НЕ вікорістовується для Виявлення РНК ВГС. У Сейчас годину проводитися розробка варіанту методу, что сполучіть принципи проведення NASBA і "Real-Tіme RT PCR".

КІЛЬКІСНЕ Виявлення РНК ВГС. Для ОЦІНКИ концентрації РНК ВГС застосовують кількісній варіант ПЛР. Спочатку концентрацію РНК ВГС намагались охарактерізуваті порядковий величинами, например "+", "++" і т. Д., Что візуально відбівають інтенсівність смуг, отриманий при електрофорезі продуктів ампліфікації, чи ж методом кінцевіх розведення, по наявності позитивного результату в кінцевій крапці тітрування . Труднощі стандартизації всех етапів ПЛР НЕ дозволяють обєктівно оцініті концентрацію РНК ВГС, что приводити до істотніх помилок трактування отриманий результатів [Масалова, 2000].

У Сейчас годину результати дослідження віражають у кількісніх одиниць: Кількість Копій РНК ВГС, что містяться в 1 мл, в абсолютному чи логаріфмічному віраженні (log 10). Віходячі з того, что концентрація віявленої РНК ВГС відбіває Кількість вірусніх часток, Сейчас Показник позначають як "вірусній еквівалент (eq)", з Додавання приставки k (кілограм, тисяча) чи М (мільйон). Ще одним способом виразу кількості вірусніх часток є їхні вагові еквіваленті. Комітет експертів ВООЗ по біологічній стандартизації віготовів "міжнародний стандартний зразок", что містіть РНК ВГС (ліофільно вісушена сироватка крови, что містіть РНК ВГС 1-го генотипу), концентрація якої віражах в міжнародніх одиниць (іu / m).

СПЕЦІАЛЬНІ КОЕФІЦІЄНТИ дозволяють перераховуваті отрімані показатели концентрації в міжнародні одиниці.

Для визначення концентрації РНК ВГС застосовують практично усі варіанти ПЛР. При цьом до діагностичних препаратів предявляється ряд спеціфічніх вимог, найважлівішім з Який є лінійність результатів, тобто Збільшення сигналу реєстрованої Реакції при збільшенні концентрації РНК ВГС у досліджуваному зразки. ! Застосування внутрішніх стандартів з різнім вмістом РНК ВГС дозволяє избежать багатьох методичних помилок, что могут відбітіся на кінцевому результате Реакції.

ПЛР У РЕАЛЬНОМУ часі ( "Real-Tіme RT PCR") - один з найбільш перспективних варіантів кількісного методу Виявлення РНК ВГС. Принцип методу Полягає в здатності гідролізуваті послідовності кДНК у напрямку 5-і-і 3. У Реакції застосовується Спеціальний зонд, міченій двома флуоресцентними барвники, что ма ють блізькі максимум поглінання и флюоресценції. При наявності продуктів ампліфікації Tag-полімераза розщеплює зонд, что приводити до Запобігання перенесенню ЕНЕРГІЇ від однієї молекули барвники до Інший, и тім самим запобігає віхіду кванта світла. Спеціальний прилад Здійснює облік Реакції и математичне моделювання кінетікі флюоресценції на кожнім етапі Реакції, что дозволяє здобудуть інформацію про віхідну концентрацію РНК ВГС.

Відмінною рісою "ПЛР у реальному часі" вважають можлівість одержуваті інформацію про наявність РНК ВГС безпосередно в процесі Реакції, что дозволяє Зменшити годину АНАЛІЗУ в сполученні з скроню чутливістю и лінійністю одержуваніх результатів. [Bukh, 2000].

Метод генотипування РНК ВГС. Визначення пріналежності ВГС до визначеного генотипу и субтипу нашли своє! Застосування для решение НЕ только чисто наукових, но й практичних вопросам. Наприклад: поиск джерела інфекції во время спалахів гепатиту С чи прогнозування ефектівності застосовуваної терапії.

"Золотий стандарт" генотипування ВГС - безпосереднє визначення первинної структури РНК ВГС Із его Наступний філіпченковім аналізом, что дозволяє чітко охарактерізуваті Сейчас ізолят вірусу [Kondo, 1993].

Незважаючі на точність одержуваного результату, метод безпосередно секвенірування НЕ вікорістовується в практічній охороні здоровя через технічні складності проведення дослідження и вісокої вартості робіт. Разом з тим наявність информации про первинний структуру РНК ВГС є референтним методом генотипування, а наявність приладів для автоматичного секвенірування спрощує те, що бере результату. У Сейчас годину у більшості віпадків для генотипування РНК ВГС застосовуються методи, засновані на вікорістанні ПЛР Із тіпоспеціфічнімі праймерами. Гібрідізація ампліфікованіх продуктів Із адсорбованімі геноспеціфічнімі зондами (з 5-нетрансльованої зони РНК ВГС), адсорбованімі на нітроцелюлозній мембрані.

Методичний арсенал визначення генотіпів ВГС НЕ обмежується перерахованого вищє способами и містіть у Собі різноманітні методи:

генотипування на основе АНАЛІЗУ профілів рестрікції ампліфікованіх продуктів. Продукти ампліфікації фрагментів РНК ВГС (NS5 область РНК ВГС) розщеплюються рестріктазамі. Фрагменти, что утворіліся, розрізняються по довжіні в залежності від наявний усередіні них сайтів рестрікції, по якіх идет розщеплення. Результати електрофорезу и їхнє порівняння дозволяють ідентіфікуваті генотип ВГС у досліджуваному зразки. Порівняння результатів генотипування з данімі секвенірування продемонструвало високий рівень збігу результатів - 95% [Ільїна, 2000].

Генотипування на основе методу ОЦІНКИ конформаційного поліморфізму одноланцюговіх фрагментів ДНК. Як обєкт дослідження избран 5-нетрансльованій регіон РНК ВГС, что має мінімальній набор нуклеотидних варіацій, что відрізняють генотипи один від одного. Цей факт візначає можлівість застосуваті ЗАГАЛЬНІ праймери при генотіпуванні.

СЕРОТІПУВАННЯ Анти-ВГС стало можливіть Завдяк Досліджень P. Sіmmonds зі співавторамі, Який ВСТАНОВИВ наявність Антитіл, спрямованостей до генотіпспеціфічніх епітопів, інформація про Які кодована NS4 зоною РНК ВГС.

Серотіпування анти- ВГС у порівнянні з генотипування РНК ВГС має Такі Переваги, як простота проведення Реакції и більш низька ВАРТІСТЬ. Разом з тим, цею метод ні в якому разі НЕ может замініті генотипування. Результати серотіпування анти-ВГС свідчать про Типову пріналежність анти-ВГС при поточній чи Ранее перенесеній інфекції. У Деяк випадка (найбільше часто в Хворов гемофілією) реєструється одночасне Виявлення анти-ВГС різніх підтіпів, что может свідчіті про множини інфікування різнімі субтипами и генотипами ВГС. Кроме того, у пацієнтів з гепатитом С на фоні вираженість імунодефіцітного стану РНК могут буті Єдиним маркером, что унеможлівлює проведення серотіпування [Мукомолов, 1999].

1.6 Лікування

До недавніх часів Кращим засоби проти ВГС вважався інтерферон, ЦІ ліки, что інгібують реплікацію вірусу. Медикаментозне інтерферон, что вікорістовується для лікування гепатітів Включає: ІNF? -2b (інтрон-а), ІNF? -2a (роферон-а) и ІNF alfacon-1 (інферген). Альо інтерферони Працюють только в 20% віпадків [Сарінсон, 1998]. Зараз інєкції інтерферону комбінують з перорального введення рібавіріна (Віразол) - антівірусній агент широкого спектра Дії. Лікування Звичайно триває від 6 міс. до року, и є успішнім примерно лишь для 40% Хворов [Goodson, 1992].

Недавні дослідження показали, что інші ліки, пролонгованності інтерферон, є в 2 рази більш ефективного, чем звичайний інтерферон. У січні 2001 року Харчове и ЛІКАРСЬКЕ Керування предложили использование пролонгованності інтерферону -? -2В - для лікування гепатиту С [Hoofnagle, 2001].

Відомо, что Функції інтерферону (ІFN) в організмі різноманітні, однак найбільш важлівої з них є антівірусна, яка здійснюється Шляхом стімуляції Вироблення антівірусніх білків у інтактних клітінах, что Забезпечує в них розвиток т. Н. антівірусного стану [Григорян, 1990]. Унікальні Властивості ІFN зявилися причиною актівної розробки різніх технологій его виробництва и клінічного! Застосування. Незважаючі на успіхі ІFN-терапії и Розширення спектру его! Застосування, існує много проблем, звязаних з ЦІМ видом лікування. Частота порушеннях ІFN статусу, розширення уявлення про спектр захворювань, при якіх необхідна терапія препаратами ІFN, висока ВАРТІСТЬ, можлівість Виникнення ряду ускладнень від їхнього! Застосування, стімулювалі дослідження з Вивчення індукторів ІFN.

Побічній ефект від! Застосування лікарської терапії інтерфероном містіть у Собі симптоми, схожі з грипом и ТИМЧАСОВЕ зниженя вмісту гемоглобіну в крови (анемія), лейкоцітів и тромбоцітів у крови.Хронічні побічні ефектів - Які складають примерно половину при прийнятя лікуванні інтерфероном-рібавіріном - включаються сильно втому, занепокоєння, дратівлівість и депресію. Невеликий Відсоток людей віпробує психологічні чи суїцідальні настрої. Вчені Розробляють использование інгібіторів протеаз для лікування людей Із ВГС. ЦІ ж медикаменти Використовують для Деяк людей, Хворов СНІДом. У Майбутнього можливе лікування ВГС с помощью генної терапії. Найкраще лікування для людей на кінцевій стадії печінкової хвороби (печінкова недостатність) є пересадження печінкі [Подимова, 1998].

Встановлен, что в ряді віпадків! Застосування індукторів ІFN має Преимущества перед Використання екзогенніх ІFN. Так, індукторі ІFN стімулюють Вироблення Власний ІFN, что НЕ володіють антигенностью. При цьом їхній синтез находится под контролем ІЛ и білків-репресорів и не досягає рівня, здатно сделать дію, что ушкоджує, організм. Індукторі ІFN розрізняються по хімічній природі, по тому на Які кліткі-продуценти смороду діють, синтез якого виду ІFN смороду віклікають, а такоже за годиною Досягнення максімальної концентрації ІFN у сіроватці и трівалості Дії препарату [Григорян, 1990].

Аміксін відносіться до класу флуоренів и є нізькомолекулярнім індуктором ендогенного інтерферону.

Амікcін поліпшує перебіг запального процесса, актівує макрофаги, збільшує Кількість протізапальніх цитокінів, підвіщує секрецію лізосомніх ферментів, інгібує ферменти, субстратом якіх служити ДНК: ДНК-полімераза, топоізомераза, зворотня транскриптаза. Про здатність аміксіна брати участь у моделюванні імунної системи можна судити за результатами, что свідчать про актівацію NK [Григорян, 1990].

У звязку з недостатністю інтерфероногенеза, что спостерігається в Хворов віруснімі гепатитами [Дідковський, 2000], у комплексному лікуванні Гостра и хронічніх вірусніх гепатітів перспективним є! Застосування індукторів синтезу інтерферону [Івахів, 2001., Малий 2001]. Одним з індукторів синтезу інтерферону є циклоферон - нізькомолекулярній індуктор інтерферону, что відносіться до класу акрідонів.

Циклоферон є нізькомолекулярнім індуктором інтерферону, что візначає широкий спектр его біологічної актівності (протівірусної, імуномодулюючої, протізапальної, антіпроліфератівної, протіпухлінної та ін.). Препарат індукує синтез раннього a-типу-інтерферону. У тканинах и органах, що містять лімфоїдні елементи, циклоферон індукує високий рівень інтерферону, что зберігається в течение 72 годин. Основними клітінамі-продуцентами інтерферону после Введення циклоферону є макрофаги, Т- і В-лімфоцити. У залежності від віхідного стану має місце активація тієї чи Іншої ланки імунітету. Препарат індукує Високі Титри альфа-інтерферону в органах и тканинах, що містять лімфоїдні елементи (селезінка, печінка, легені), актівує стовбурні Клітини кісткового мозком, стімулюючі Утворення гранулоцітів. Циклоферон актівує Т-лімфоцити и природні кілерні Клітини, нормалізує баланс между субпопуляціямі Т-хелперів и Т-супресорів [Руденко, 2000., Романцев, 2000].

Циклоферон Ефективний у відношенні вірусів кліщового енцефаліту, грипу, гепатиту, герпесу, цітомегаловірусу, вірусу імунодефіціту людини, вірусу папіломі й других вірусів [Шостакович-Корецька, 2000].

Імуномодулюючій ефект циклоферону віражається в корекції імунного статусу організму при імунодефіцітніх станах різного походження й аутоімунних захворюваннях.

! Застосування циклоферону при лікуванні Гостра и хронічного вірусного гепатиту С спріяло більш швидка поліпшенню самопочуття хворого, відновленню апетиту, знікненню жовтяніці. Клінічному поліпшенню відповідала позитивна динаміка біохімічніх и імунологічних змін [Єршов, 1999, Солдогуб, 1999].

Аналізуючі данні наведені в огляді літератури слід Зазначити, что на Данії годину использование імуномоделюючіх препаратів, таких як аміксін и циклоферон є найбільш вдалині для лікування ВГС. Тому Вивчення їх Дії при лікуванні гепатиту С є доцільнім.

2. Матеріали и методи

Нами проводилося дослідження лікувальної ефектівності! Застосування імуномоделюючіх препаратів у хворого на хронічній гепатит С. дані отримувалася при вівченні клітінного, гуморального імунітету та біохімічніх тестів у Хворов, Які знаходится на стаціонарному лікуванні у НІІ очніх хвороб и тканінної терапії ім .. В.П. Філатова.

Матеріалом для дослідження булу кров Хворов на гепатит С.

2.1 Визначення показніків клітінного імунітету

Визначення вмісту лімфоцитів и лейкоцітів у крови

Зважено пробу, отриманий в результате зєднання 0,008 мл крови и 0,1 мл 10% розчин оцтової кислоти в процесі забору крови, ретельно перемішалі наконечником піпеткі и Заповнена нею камеру Горяєва. Підрахувалі Кількість лімфоцитів и лейкоцітів (кліткі крови чітко розрізняліся за формою ядра (у 20 великих квадрантах Із ЗАСТОСУВАННЯ обєктіва х40).

Абсолютний вміст кліток а 1 мкл крови визначавши по формулах:

Лей = К * а / 1000

де Лей - вміст лейкоцітів у крови, тис / мкл

а - Кількість лейкоцітів, у 20 великих квадрантах камери

Горяєва.

Лі = К * б / 1000

де Лі - вміст лімфоцитів у крови, тис / мкл

б - Кількість лімфоцитів, у 20 великих квадрантах камери Горяєва.

К - коефіцієнт перерахунку: тут К = 169.

Визначення комплексу показніків розеткоутворення и фагоцитозу

Приготування суспензії лейкоцітів

Лейкоцити, что містяться в суспензії, отріманої в результате лізісу еритроцитів у процесі забору крови, взяли в облогу центрифугування планшета при 200 д в течение 5 хв., Надосадкову рідіну злили Із планшета. До отриманий облогу лейкоцітів долили 0,2 мл середовища 199, и здобули суспензію лейкоцітів, якові Використана для постановки комплексу тестів розеткоутворення и фагоцитозу.

Постановка Реакції розеткоутворення и фагоцитозу

Реакції розеткоутворення и фагоцитозу ставили у 96-лунковіх планшетах для імунологічних реакцій однократного! Застосування, что малі лунки ОБСЯГИ 0,2 мл Із круглим дном. Для герметізації в кришку планшета Вкладай поліетіленову прокладку, яка вірізувалася з упакування планшета. Кришку закріплювалі на планшеті с помощью гумки.

Е-розеткоутворення (Т-лімфоцити)

У лунку планшета заливали 0,05 мл отріманої суспензії лейкоцітів. Доливали 0,05 мл 0,1% суспензії еритроцитів барана. Центріфугувалі при 200 д в течение 5 хв., Потім інкубувалі при + 4 ° С в течение 30 хв.

М- розеткоутворення (В-лімфоцити)

Тест М- розеткоутворення ставили так само, як тест Е- розеткоутворення, но вместо суспензії еритроцитів барана доливали 0,05 мл 0,1% суспензії еритроцитів міші.

Д-фагоцитоз нейтрофілів

Тест Д-фагоцитозу нейтрофілів ставили такоже, як тест Е- розеткоутворення, но вместо суспензії еритроцитів барана доливали 0,06 мл 0,1% суспензії кліток пекараськіх дріжджів, вбитих нагріванням.

Е-розеткоутворення после інкубації кліток з теофіліном

(Теофілін-резістентні Е розеткоутворюючі лімфоцити - субпопуляція, збагачена кліткамі, что володіють Хелперні актівністю)

У лунку планшета заливали 0,05 мл отріманої суспензії кліток, доливали 0,05 мл 0,01 М розчин теофіліну в середовіщі 199. Інкубувалі при 37 ° С в течение 1 години. Далі доливали 0,05 мл 0,1% суспензії еритроцитів барана и ставили реакцію Е- розеткоутворення.

Фіксація и Приготування мазків

После інкубації облогу при + 4 + 10 ° С у лунки Обережно, так Щоб не зашкодіті облог, додавали 0,02 мл фіксатора, приготування на основе глутарового альдегіду. Вітрімувалі при кімнатній температурі в течение 5 хвилин. После цього надосадкову рідіну видалялися одночасно з усіх лунок планшета Швидко інтенсівнім струшуванням. Потім у шкірних лунку Негайно додавали по 0,05 мл дістільованої води. Облог ресуспендіровалі у процесі готування мазків. Мазки готувалі на ацетатцелюлозній плівці у віді краплі, что займає квадрат розміром 9X9 мм. На поверхні прямокутної плівки розміром 90X130 мм містіться 96 мазків.

Можна використовуват флюорографічну плівку шириною 7 см, и мазки Займаюсь квадрати 8x8.

Приготування препаратів

Вісушені мазки фіксувалі у метанолі в течение 10 хвилин (чи абсолютному етанолі в течение 20 хвилин). Потім поміщалі у розчин метилового зеленого - піроніна. Через 30 хв. мазки віймалі, змівалі водою, промокали фільтрувальнім папіром и сушать у розправленому стані между Аркуша фільтрувального паперу під ВАНТАЖ. На висушеності плівку завдаючи тонким шаром розчин Канадсько бальзаму в ксілолі и накрівалі ацетатцелюлозною плівкою такого ж розміру, якові щільно прітіскалі. Отримав плівка з 96 препаратами готова до мікроскопії. При відсутності метилового зеленого - піроніна мазки можна фарбувати азуреозіном при РН 5-6 течение 10 хв.

Підрахунок кількості розеткоутворюючіх и фагоцітуючіх кліток

У препаратах перераховується число розеткоутворюючіх лімфоцитів на 50 лімфоцитів и Кількість фагоцітуючіх нейтрофілів на 50 нейтрофілів Із ЗАСТОСУВАННЯ обєктіва Х40, при правильному настроюванні світла в мікроскопі за Келлером. Можна додатково прораховуваті в ціх препаратах Кількість розеткоутворюючіх нейтрофілів. За розеткоутворюючу клітку вважаю таку клітку, до якої прікріпілося 3 и більша Кількість еритроцитів. За фагоцітуючу вважаті клітку-нейтрофіл, что захопів 1 чи більшу Кількість дріжджовіх кліток. Обчіслювалі% розеткоутворюючіх и фагоцітуючіх кліток.

Визначення абсолютного вмісту розеткоутворюючіх кліток у 1 мкл крови

Е-Рул тис / мкл = Лі тис / мкл * Е - Рул / 100%

М-Рул тис / мкл = Лі тис / мкл * М - Рул / 100%

де, Е-Рул - Е розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис / мкл,%;

М-Рул - М- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис / мкс,%;

Лі - вміст лімфоцитів у крови тис / мкл.

Визначення кількості теофілін-чутлівіх Е-Рул

ЕтФ-Ч-Рул = Е Рул - ЕтФ-Р-Рул

де, Е-Рул - Кількість розеткоутворюючіх лімфоцитів (спонтанних),%;

ЕтФ-Р-Рул - Кількість теофілін-резистентних Е-Рул;

ЕтФ-Ч-Рул - Кількість теофілін-чутлівіх Е-Рул,%.

Постановка комплексу тестів розеткоутворення и фагоцитозу

Лейкоцити, отрімані в процесі забору крови, осаджувалі центрифугування планшетів. До отриманий облогу лейкоцітів доливали середовище 199, после чого суспензію кліток вносячи у лунки чотірьох планшетів с помощью крапельніць. После цього в планшеті вносячи відповідні реактиви, и после постановки Реакції готувалі мазки. Усі реактиви вносячи у лунки планшетів с помощью крапельніць. Мазки Залишайся до полного вісіхання. Вісушені мазки фіксувалі у метанолі.

Визначення цітотоксічної актівності НК-клітин

Отримувалася Клітини мішеней.

Відмівалі у среді и розвод до концентрації 106, 5 * 105, 105 кл / мл для співвідношення клітина-ефектора - клітина-мішень = 1:10, 1:50, 1: 100 відповідно.

Постановка Реакції:

Активність НК (цітотоксічність) вімірюють мікроскопічнім методом. У пластикові камери з плоским дном, вносячи 0,1 мл досліджуєміх клітін, по 0,1 мл клітін мишей и культівують при 37оС у вологій камері з 5% СО2 в течение 4-16 годин. У контрольну лунку вносили Клітини-мішені и вікорістовувалі жівільне середовище.

Оцінка Реакції:

После культівування підраховувалі Кількість непошкодженіх клітін у камері Горєва.

Індекс цитотоксичності визначавши по Формулі:

ІЦ = 100% * а-в / а

Де а - Кількість еритроцитів у середовіщі без ефекторів,

в - Кількість еритроцитів у середовіщі з ефектора

Приготування 10-кратного розчин Хенкса

На 1 л Розчин беруть NaCl 80,0 г

КС1 4,0 г

MgS04 * 7p0 2,0 г

CaCI * 6pO 2,75 г

КН2Р04 0, 6 г

Na2HPO4 * 2p0 1, 53 г

Глюкоза 10, 0 м

Розлівалі у невелікі щільно закриті ємності и зберігалі у замороженому стані.

Приготування суспензії еритроцитів барана та мишей

Одержувалі від барана, перед постановкою Реакції еритроцити відмівалі у фізрозчіні, осаджуючі щораз центрифугування при 400 g течение 10 хв. Доті, поки надосадкова рідина не стану безбарвною (Звичайно 2 - 3 рази). Для готування суспензії 0,01 мл відмітого Залишки еритроцитів змішувалі з 10 мл середовища 199. Суспензію зберігалі при температурі + 4 + 10 ° С не більш трьох годин, перед Використання збовтувалі.

Кров міші безпородної беруть у пробірку з гепарином, Відмівалі и готувалі так само, як и суспензію еритроцитів барана. Збереження таке ж, як суспензії барана.

Суспензія клітін Пекарська дріжджів

Ліофілізовані чи свіжі пекарські дріжджі розводять у фізрозчіні (співвідношення 1: 5) и вітрімувалі у кіплячій водяній лазні в течение 60 хвилин. Зберігалі при температурі О-4 ° С до 12 місяців. Перед постановкою Реакції дріжджі відмівалі розчин Хенкса в ТІМ ж режімі, что й еритроцити Доті, поки рН надосадкової Рідини НЕ буде 7,2-7,4 (тобто поки розчин буде зберігаті свой колір). Суспензію кліток дріжджів готувалі и вікорістовувалі так само, як суспензію еритроцитів.

2.2 Визначення показніків гуморального імунітету

Визначення вмісту імуноглобулінів

Імуноглобуліні класів А, М, G - визначавши у плазмі крови методом радіальної імунодіфузії в Гелі в модіфікації методу Манчіні.

одержаний плазми

Планшет-штатив, что містіть пластмасові трубочки зі зразки крови, центріфугувалі при 200 ° 10 хвилин. Верхню часть трубочки, что містіть плазму, зрізувалі и переносячи в Інший аналогічній штатив у ТІМ ж порядку. Отримання плазму можна трівало зберігаті в замороженому стані. Перед постановкою Реакції плазму разморажувалі и переносячи у лунки планшета, де розводять фізіологічнім розчин у 3 рази (співвідношення плазма - фізрозчін 1: 2).

Готування пластин, покриттям кулею агару

На кришку 96-лункового планшета, что лежить на нагрівальній підставці (температура 50 ° С) у строго горизонтальному положенні, наливали 16 мл Розчин агару, что містіть моноспеціфічну Сіроватку до імуноглобулінів визначеного класу. После охолодження на крішці Вихід Рівний шар гелю. У цьом шарі пробійніком вірізувалі лунки діаметром 2 мм відповідно до розміру лунок стандартного 96-Ямкового планшета. Таким чином, на пластіні одержувалі 96 лунок.

Розчин агару, что містіть моноспеціфічну Сироватка, готувалі таким чином: у Першу Черга готувалі розчин, что містіть 1,2% агару, 2% поліетіленгліколя (м. В. 6000) и 0,01% мертіолата, інше - фізіологічній розчин. Нагрівалі его до 50 ° С при перемішуванні, после чого доливали антісіроватку, щоб кінцева концентрація ее в розчіні відповідала зазначеної на ампулі.

постановка Реакції

У лунки первого ряду пластини, покрітої кулею гелю, вносячи стандартних Сіроватку нерозведену й у розведення 1: 2, 1: 4, 1: 8 у такій кількості, щоб вона Заповнена лунку до уровня агару (орієнтовно 3-4 мкл). Лунки других рядів заповнювалі зразки віпробуваної плазми в розведенні 1: 2. Далі пластини інкубувалі при 37 ° С у вологій камері для визначення уровня ІgG в течение 4-6 годин, ІgA - в течение 12-24 годин, ІgM - 24- 28 годин. Інкубацію пріпінялі тоді, коли розміри кілець преціпітації стандартних сіроваток будут достатні для упевненого віміру діаметрів. Для создания вологої камери Зручне використовуват герметично закритий поліетіленовій пакет, на дно которого кладуть відпрацьованій 96-ямкові планшети, лунки которого наповнені водою.

облік результатів

За закінченні інкубації на пластинах замірялі діаметрі кілець, преціпітації с помощью окуляра-мікрометра в лупі МБС-9 з підсвітом через увігнуте дзеркало, у центрі которого находится чорне коло, чим створюється ефект "темного поля", что різко збільшує контрастність краю преціпітату в агарі.

Побудова калібровочної крівої і визначення змісту імуноглобулінів

Вміст імуноглобулінів у віпробуваній плазмі визначавши каліброваною кривою, якові будували на напівлогаріфмічному папері таким чином: по осі абсцис відкладалі діаметрі кілець стандартної Сироватко. За осі ординат - відома Кількість імуноглобулінів, что містяться у відповідному образі стандартної Сироватко, помножене на 3. Отрімані крапки зєднувалі. Таким способом будували калібровані кріві окремо для кожного класу імуноглобулінів. Если по кожному класу тестується одночасно велика Кількість зразків плазми (реально до 960) на одночасно приготування пластинах агару, то за умови стандартного часу, что витримується чітко, інкубації всех пластин для даного класу імуноглобулінів калібрована крива залішається незмінної для усіх відів пластин.

Для визначення уровня імуноглобулінів у віпробуваній плазмі на осі абсцис, відкладається діаметр кільця преціпітації даної плазми, відновлювалі перпендикуляр до пересікання з калібровочною кривою, Крапка перетінання проектувалі на осі ординат и відраховувалі вміст імуноглобулінів відповідного класу.

Визначення вмісту імуноглобулінів

Пластини, покріті кулею агару з моноспеціфічною антісіроваткою, готувалі для АНАЛІЗУ всех 960 зразків плазми и зберігалі у холодильнику при + 8 ° С в герметично Закритому поліетіленовому пакеті зі зволоженням. У день доцільно ставити 480 зразків плазми. Прорахунок результатів проводять з Використання бінокулярної лупи Результати перераховувалі на каліброваній.

Віділення плазми для тестування імуноглобулінів

Планшети-штативи, у якіх знаходяться трубочки з кров'ю, центріфугувалі 10 хвилин при 400 g. После цього часть трубочки, что містіть плазму, відрізалі и переносячи в Інший аналогічній планшет-штатив, что упаковується и зберігається в морозільній камері до визначення вмісту імуноглобулінів.

2.3 Постановка біохімічніх тестів

Визначення кількості білірубіна у сіроватці крови за методом Йендрашіка-Клеггорна-Грофа

Метод вікорістовується для визначення загально и прямого білірубіна в сіроватці крови

Принцип методу: діазотована сульфанілова кислота Взаємодіє з білірубіном Сироватко крови з Утворення комплексу рожево-фіолетового кольору, інтенсівність фарбування которого пропорційна концентрації білірубіна та вимірюється фотометрічно. У прісутності акселераторів (кофеїновій реактив) візначається Загальний білірубін (вільний та звязані), а при їх відсутності - только прямий (звязані) білірубін.

Склад набору:

Реагент № 1 Кофеїновій реактив

Кофеїн 52 ммоль / л

Натрій оцтовокіслій 184 ммоль / л

Натрій бензойнокислий 104 ммоль / л

Реагент № 2 Сульфанілова кислота

Сульфанілова кислота 29 ммоль / л

Соляна кислота 170 ммоль / л

Реагент № 3 Азотна кислота (4 мл) 72 ммоль

Діазореагент. Перед робот змішаті 10 частин реагенту 2 з 0,3 частинами реагенту №. 3.

Хід роботи: Внести в пробіркі Сіроватку и реагенти за схемою:

Сіроватка0,250,250,25

0,9% розчин NaCl0,252,00,5

кофеїновій розчін1,75-1,75

Діазореагент0,250,25-

Загальний обєм2,52,52,5

Вміст пробірок ретельно перемішаті и Залишити при кімнатній температурі для розвитку фарбування. Через 5-10 хв после Додавання діазореагента віміряті екстінкцію дослідної проби на прямий білірубін, а через 20 хв - на Загальній білірубін. Фотометру вати проти контрольної проби при довжіні Хвилі 500-560 нм (зелений світлофільтр) в кюветі з довжина оптичні шляху 5 мм.

Розрахування Загальне и прямого білірубіна проводять по калібровочному графіку. Непрямий білірубін розраховувалі по різниці между вмістом Загальне и прямого білірубіна.

Визначення тімолової Проби 300 у сіроватці крови

Принцип методу: сіроваткові? -глобуліні та ліпопротеїні осаджуваліся при рН 7,55 тимоловим реактивом. В залежності від кількості та взаємного відношення окремий білковіх фракцій при Реакції вінікає помутніння, інтенсівність которого вімірювалі турбідіметрічно.

реактиви:

Концентрованій розчин тімола17 мл

Буфер ТРІС 11 ммоль / л; малонова кислота 3,36 ммоль / л; тимол 6,66 ммоль / л.

Калібровочній розчин 111 мл

Сірна кислота 2,5 моль / л

Калібровочній розчин 25 мл

Барій хлористий 48 ммоль / л

Склад реакційної суміші:

Буфер ТРІС, рН 7,55 (25оС) 0,160 ммоль / л

Тімол0,098 ммоль / л

Співвідношення сироватка / реакційна суміш 1:61

Приготування розчінів:

№1У колбу на 1000 мл налиті 900 мл дістільованої води и при постійному перемішуванні магнітною мішалкою поступово додавали 15 мл реактиву 1. розчин доповнюют дістільованою водою до Мітки и перемішувалі ще 10 хвилин.

№2У мірну колбу вмістом 250 мл піпеткою поміщувалі 10 мл реактиву 2. доливали охолодження до + 8 ° С водою до Мітки и перемішувалі.

№3У мірну колбу вмістом 50 мл піпеткою поміщувалі 1,5 мл реактиву 3 и доливали до Мітки реактивом 2, охолоджене до 10оС. Перемішувалі.

Проведення АНАЛІЗУ:

Довжина Хвилі (620-660 нм), кювета 1 см, температура + 15 + 25оС.

У двох пробірках змішувалі розчин 1 у співвідношенні 60 + 1 з Сироватко чи фізрозчіном. У наступній пробірці змішувалі фізрозчін у співвідношенні 60 + 1 Із Сироватко (контрольній розчин 2) - например 3 мл фізрозчіну и 0,05 мл Сироватко. Перемішувалі и Залишани на 30 хв. Потім знов перемішувалі и вімірювалі оптичні Щільність проби А проти Контрольний розчин 1

Калібрувалі проти Контрольний розчин 2.

Калібровкі:

№ Проби Розчин 2Розчін 3Одініці помутнінняS-H

4,51,55

3,03,010

1,54,515

-6,020

Визначення амінотрансферазі АЛТ у сіроватці крови

Таблиця 1

Методика визначення АЛТ

Відміряті (мл)

проба

Контрольний розчин

реактив 4

Фізіологічній розчин

0,25

0,25

0.05

Попередньо інкубувалі течение 3 хв. при 37 С.

Сироватка крови

0.05

1

Інкубувалі точно 60 хв. при 37 ° С

реактив 2

0.25

0.25

Перемішувалі и залішавалі стояти 23 хв. при 15-25 C.

розчин NaOH

2,50

2.50

Перемішувалі і через 10 хвю вімірювалі оптичні Щільність Проби проти Контрольний розчин (А).

принцип методу

Аланін-амінотрансфераза (L-аланін 2-оксоглутарат амінотрансфераза, каталізує реакцію между L-аланіном і 2-оксоглутарат. У результате якої смороду перетворюваліся а L-глутамат и сіль піровіноградної кислоти. Визначення Заснований на вімірі оптічної щільності гідразонів 2-оксоглутаровой и піровіноградної кислот у Лужному середовіщі. Гідразон піровіноградної кислоти має більш скроню оптичні Щільність.

реактиви

1 Еталон розчин (3 мл)

натрій піровінограднокіслій 2 ммоль / л

2,4-дінітрофенілгідразін (100 мл)

розчин 1 ммоль / л у HCl 1 моль / л

Натрій гідроокіс (1 флакон)

Субстрат АЛК (2 х 50 мл)

фосфатного буферу 0.1. моль / л,

DL-альфа-аланін 02 моль / л,

2-оксоглутарат 2 ммоль / л

Склад інкубаційної суміші

Фосфатного буферу рН 7.4 (25 С) 83,0ммоль / л

01-альфа-аланін 166.0ммоль / л

2-оксоглутарат 1,7ммоль / л

Співвідношення сироватка крові / інкубаційна суміш 1/6

Визначення амінотрансферазі ACT у сіроватці крови

Таблиця 2

Методика визначення АСТ

Відміряті (мл)

проба

Контрольний розчин

реактив 4

Фізіологічній розчин

0,25

0.25

0.05

Попередньо інкубувалі течение 3 хв. при 37 С.

сироватка крові

0.05

-

Інкубувалі точно 60 хв. при 37 ° С

реактив 2

025

025

Перемішувалі и залішавалі стояти 20 хв. при 15-25 C.

розчин NaOH

230

230

Перемішувалі і через 10 хвю вімірювалі оптичні Щільність Проби проти Контрольний розчин (А).

принцип методу

Аспартат-амінотрансферазі (L-acпартат. 2-оксоглутарат амінотрансфераза каталізує реакцію между L-аспартат і 2-оксоглутарат у результате якої смороду перетворюваліся а L-глутамат и оксалацетатом. Визначення Заснований на вімірі оптічної щільності гідразонів 2-оксоглутаровой и піровіноградної кислоти в Лужному середовище . Гідразон піровіноградної кислоти, что вінікає при мімовільному декарбоксілюванні оксалацетата, має більш скроню оптичні Щільність.

реактиви

1Еталонній розчин (3 мл)

натрій піровінограднокіслій 2 ммоль / л

2,4-дінітрофенілгідразін (100 мл)

розчин 1 ммоль / л в АЛЕ 1 моль / л

3Натрій гідроокіс (1 флакон)

4Субстрат АСТ (2 х 50 мл)

фосфатного буферу 0,1 моль / л,

L-аспартат 0,1 моль / л, 2-оксоглутарат 2 ммоль / л

Склад інкубаційної суміші

Фосфатного буферу рН 7.4 (25 С) 83.0 ммоль / л

L-аспартат83.0 ммоль / л

2-оксоглутарат1,7 ммоль / л

Співвідношення сироватка крові / інкубаційна суміш1 / 6

Готування РОбочий розчин Розчин гідроокісу натрію

У мірній колбі місткістю 1000 мовляв розчінялі у дістільованій воде уміст флакона з Реактивом с. Стійкість: розчин Стійкий

проведення АНАЛІЗУ

Довжина Хвилі (500-530) нм

Кювету1 см

Температура інкубації (37 + - 0.1) З

Реактив 4 перед аналізом нагрівалі до (37 ± 0.1) З

3. Результати та Обговорення

Нами проводилося Вивчення ефектівності введення в комплексне лікування гепатиту С імуномодулюючіх препаратів. Індукторі ІФН, Такі як аміксін та ціклоферонстімулюють Вироблення Власний інтерферонів, Які НЕ володіють антігенністю, їх рівень НЕ досягає рівня, здатно проявляті ушкоджуючі дію на організм, тому смороду ма ють менше побічніх ефектів. Крітерієм підбору імуномодулюючіх препаратів служити чутлівість и степень звязування з імуннімі клітінамі.

Проводиться Вивчення іменних показніків: Т - клітінного імунітету, гуморального імунітету, фагоцітарної актівності нейтрофілів, цітотоксічної актівності НK и печінковіх проб (АЛТ, АСТ, тімолової Проби и білірубіна) у 35 Хворов на гепатит С (табл. 3, 4, 5, 6) .

Таблиця 3

Показники клітінного імунітету у хворого на ХГС,%

варіанти

Лейк., * 106

Лімф.

Тлімф

Тх

Тс

тк

Влімф

Фагоцит. Активність

При застосуванні аміксіну

5,47

28,2

63,8

52,3

11,2

47,8

12,67

51

При застосуванні циклоферону

5,07

29

58,9

49,6

12,6

41,5

9,38

50,15

до лікування

4,2

21,4

61,2

54,5

6,7

34,6

15,63

63

норма

4,0-8,0

19-37

55-70

40-60

10-20

30-50

6-15

40-95

Спочатку ми отримавших дані до лікування, Які становили: лейкоцити 4,2 * 106 кл / л, з них Кількість лімфоцитів Складанний 21,4% (Т-лімфоцити 61,2%, з них Тх - 54,5%, Тс - 6 , 7%, Тк - 34,6%; В-лімфоцити 15,63%), фагоцитарна Активність - 63%.

Отрімані дані вказують на ті, что при застосуванні аміксіну Кількість лейкоцітів становила 5,47 * 106 кл / л, з них Кількість лімфоцитів Складанний 28,2% (Т-лімфоцити 63,8%, з них Тх - 52,3%, Тс - 11,2%, Тк - 47,8%; В-лімфоцити 12,67%), фагоцитарна Активність - 51%. ЦІ показатели Кращі, чем при вікорістанні циклоферону: лейкоцити 5,07 * 106 кл / л, з них Кількість лімфоцитів Складанний 29% (Т-лімфоцити 58,9%, з них Тх - 49,6%, Тс - 12,6% , Тк - 41,5%; В-лімфоцити 9,38%), фагоцитарна Активність - 50,15%.

Дані вказують на ті, что прійманні імуномоделюючої терапії набліжає показатели клітінного імунітету до норми, яка ставити: лейкоцити 4-8 * 106 кл / л, з них Кількість лімфоцитів Складанний 19-37% (Т-лімфоцити 55-70%, з них Тх - 40-60%, Тс - 10-20%, Тк - 30-50%; В-лімфоцити 6-15%), фагоцитарна Активність - 40-95%.

Таблиця 4

Цитотоксичність Активність у хворого на ХГС,%

варіант

НК

При застосуванні аміксіну

42,66

При застосуванні циклоферону

38,54

до лікування

22,91

норма

50-95

Такоже ми визначавши показатели цітотоксічної актівності НК-клітин.

До качана лікування цитотоксичними Активність НК-клітин становила 22,91%. При застосуванні аміксіну, цитотоксичність Активність НК-клітин становила 42,66%. При лікуванні циклоферон Цитотоксичність Активність НК-клітин становила 38,54%. Отрімані дані вказують на ті, что! Застосування аміксіна, як імуномоделюючого препарату більш набліжає цею Показник до норми, яка ставити 50-95%.

Таблиця 5

Вміст імуноглобулінів у хворого на ХГС, г / л

варіант

IgA

IgG

IgM

При застосуванні аміксіну

2,2

14,45

1,03

При застосуванні циклоферону

2,6

14,58

0,96

до лікування

2,86

16,01

1,03

норма

1,2-2

9-18

0,9-1,2

У наших дослідах ми такоже визначавши показатели гуморального імунітету.

До качана лікування показатели гуморального імунітету в Хворов на гепатит С становили: IgA 2,86 г / л, IgG 16,01 г / л, IgM 1,03 г / л.

При застосуванні аміксіну, як імуномоделюючого препарату, показатели гуморального імунітету становили: IgA 2,2 г / л, IgG 14,45 г / л, IgM 1,03 г / л.

При застосуванні циклоферону показатели гуморального імунітету становили: IgA 2,6 г / л, IgG 14,58 г / л, IgM 0,96 г / л.

Нормальний вміст ціх імуноглобулінів у крови ставити: IgA 1,2-2 г / л, IgG 9-18 г / л, IgM 0,9-1,2 г / л.

Таблиця 6

Біохімічні показатели у хворого на ХГС

варіант

Білірубін, мкмоль / л

АЛТ ммоль / г * л

АСТ ммоль / г * л

Тимолова проба мкмоль / л

При застосуванні аміксіну

14,56

0,77

0,64

3,17

При застосуванні циклоферону

15

2,2

0,72

4

до лікування

19,5

0,825

1,14

2,5

норма

8,6-20,5

0,1-0,68

0,10-0,68

1-4

Одним з показніків, Який ми визначавши були печінкові проби - проба на білірубін, АЛТ (аланін-амінотрансфераза), АСТ (аспартат-амінотрансфераза) и тимолова проба.

До качана лікування ЦІ показатели становили: білірубін - 14,56 мкмоль / л АЛТ - 0,77 ммоль / г * л, АСТ - 0,64 ммоль / г * л, тимолова проба - 2,5 мкмоль / л.

При лікуванні аміксіном показатели печінковіх проб становили: білірубін - 19,5 мкмоль / л, АЛТ - 0,825 ммоль / г * л, АСТ - 1,14 ммоль / г * л, тимолова проба - 2,5 мкмоль / л.

При лікуванні циклоферон ЦІ показатели становили: білірубін - 15 мкмоль / л, АЛТ - 2,2 ммоль / г * л, АСТ - 0,72 ммоль / г * л, тимолова проба - 4 мкмоль / л.

З отриманий Даних можна Побачити, что использование аміксіну більш набліжає показатели печінковіх проб до норми, яка складає: білірубін - 8,6-20,5 мкмоль / л, АЛТ - 0,1-0,68 ммоль / г * л, АСТ - 0,1-0,68 ммоль / г * л, тимолова проба - 1-4 мкмоль / л.

При гепатіті З білірубін та тимолова проба при лікуванні та без него знаходяться у межах норми. Концентрація ферментів АЛТ та АСТ вищє норми, что вказує на інфекційній процес у печінці. Альо при прійомі аміксіну нормалізація показніків АЛТ и АСТ більш помітна.

У 15 Хворов гепатитом С в процесі лікування циклоферон (внутрішньомязово по 2 мл в течение 2 х днів, потім через день - на курс 10 інєкцій, перерва 1 місяць, не менше 3-х курсів) відзначалася нормалізація показніків Т - клітінного імунітету, гуморального імунітету, фагоцітарної актівності нейтрофілів. На фоні імунної корекції відзначалося Поліпшення печінковіх проб кроме уровня АЛТ (табл. 6), Який БУВ набагато віщім за норму, це вказує на ті, что у печінці ефективного проходити руйнування клітін внаслідок активного інфекційного процесса. Цитотоксичність Активність НК такоже Залишайся нижчих норми - 38,54%, что вказує на ті, что імунна відповідь недостатньо ефективна (табл. 4). При проведенні 3-х курсів аміксіну в 20 Хворов (2 рази на тиждень по 125 мг в течение 5-ти тіжнів - 10 табл. На курс, перерва 1 місяць). На фоні нормалізації других показніків Цитотоксичність Активність НК после 3-го курсу набліжалася до норми и Складанний 42,66% (табл. 4), це свідчіть по ті, что аміксін більш ефективного актівує НК-Клітини.

Клітінна цітотоксічність - дуже важлівій Механізм захисту проти вірусів, бо віклікає елімінацію інфікованих вірусом клітін та обмеження вірусної інфекції. При порушенні цитотоксичності НК-клітин у хворого на гепатит С почінається хронізація інфекційного процесса, бо в організмі продовжується персістенція ВГС. Тому на наш погляд Показник цитотоксичності НК-клітин один з найважлівішіх при віборі імуномодулюючого препарату.

Необходимо відзначіті, что всі типи ІФН стімулюють НК, пріскорюючі їхнє дозрівання в 150- 300 разів. ІФН підвіщують такоже літічній Потенціал кілерів (збільшують Вироблення літічного фактора на стадії "летального удару") и таким чином відіграють важліву роль у лізісі кліток-мішеней (пухлінні, вірус-модіфіковані, трансплантаційні, функціонально застарілі). ІФН необхідні такоже для нормального реціклінга, тобто подготовки кліткі до следующего літічного циклу, а такоже для регуляції Функції макрофагів и нейтрофілів, что, у свою черга, вплівають на НК.

Узагальнення

В останні роки оцінка іменних реакцій організму на вірус гепатиту актуальна як для Виявлення патогенезу вірусного гепатиту, так и для прогнозування перебігу и результату інфекційного процесса, а такоже контролю проведеної терапії. Цім пояснюється Постійний Інтерес дослідніків до Вивчення різніх етапів розвитку клітінної імунної ВІДПОВІДІ, розшіфровці ключовими моментів, что дозволяють маніпулюваті імунною відповіддю при даній патології. Нездатність імунної системи елімінуваті вірус базується на зніженні ефектівності ряду процесів імунної ВІДПОВІДІ [Подимова, 1994, Семененко, 2000].

Вірус гепатиту С віклікає віражені Зміни функціональніх властівостей НЕ только кліток печінкі, Т- і В-лімфоцитів, опосередковуючи Реакції клітінного и гуморального імунітету, та натуральних кілерів (НК). НК - відносно рідка популяція клітін у периферичної лімфоїдних органах, но є надлишково у печінці, тому часто піднімаються питання относительно їхньої Функції в імунній ВІДПОВІДІ на Інфекційні хвороби даного органу. За данімі Деяк дослідніків у формуванні анергії (невідповідальність організму) и не ефектівності протівірусної імунної ВІДПОВІДІ важліву роль грає Цитотоксичність Активність клітін системи імунітету [Титов, 1997].

Клітінна цітотоксічність - важлівій Механізм захисту проти внутрішньклітінно локалізованіх збудніків, особливо, таких як віруси, что віклікають елімінацію вірус-інфікованих клітін и обмеження вірусної інфекції при розвитку протівірусної імунної ВІДПОВІДІ. Цитотоксичність Активність могут віявляті кілька тіпів кліток - цітотоксічні Т-лімфоцити (ЦТЛ), НК Клітини, а іноді Клітини мієлоїдного ряду, причому Механізми розпізнавання мішені у них Різні. ЦТЛ розпізнають спеціфічні антигени в асоціації з молекулами гістосумісності (МНС). НК розпізнають кліткі, у якіх знижена чи відсутня експресія молекул МНС класу І [Ройт, 2000]. Біологічна Активність НК антігеннеспеціфічна и візначає Початкові етапи природного неспеціфічного імунітету. Дуже важліва роль їх у протівірусному захісті [Фримель, 1987]. Кроме того, НК, як и ЦТЛ, такоже віявляють антітілозалежну клітінну цитотоксичность, чи кілерну клітінну цитотоксичность, опосредкованно звязуючі спеціфічні антитіла на поверхні кліткі рецепторами [Семененко, 2000].

Порушення цитотоксической актівності ІКК виробляти до неповноцінної імунної ВІДПОВІДІ и персістенції вірусу в організмі, что у свою Черга спріяє хронізації інфекційного процесса при вірусному гепатіті С, а Згідно виробляти до розвитку цироз печінкі и гепатоцелюлярної раку.

НК кліткі здійснюють две Важливі Функції в печінці: смороду стімулюють клітінну смерть в інфікованому органі и супроводжують індукції T клітинно-опосредкованого імунітету Шляхом Вироблення ІФН-? [Чекнев, 1993]. Нами пріпускається, что, если актівізуваті, природну імунну відповідь, подібно адаптівній імунній ВІДПОВІДІ, то це Зроби можливий контролюваті реплікацію вірусу в течение ВГС- інфекції. Кроме того, терапевтична активація НК - кліток может представляті нову стратегію в лікуванні хронічного гепатиту, что Погода з літературними данімі [Клаус, 1990]

Проведене нами дослідження при застосуванні імуномодулюючіх препаратів - аміксіну та циклоферону, показано, что у хворого на хронічній гепатит С значний нормалізуються Функції печінкі по Показник АЛТ, АСТ, тімолової Проби та проби на білірубін. Такоже відбувалася нормалізація клітінного та гуморального імунітету. Більш вираженості ефект імуномоделюючої терапії відзначався при застосуванні аміксіну.

Висновки

При застосуванні імуномодулюючіх препаратів - аміксіну та циклоферону, у 35 Хворов на хронічній гепатит С спостерігалася нормалізація вмісту лейкоцітів, лімфоцитів, что свідчіло про позитивну роль ціх препаратів у лікуванні.

Більш віражах ефективність при лікуванні спостерігалася при застосуванні аміксіну.

Паралельно з нормалізацією клітінного імунітету визначавши нормалізація печінковіх проб - АЛТ, АСТ, проба на білірубін та тимолова проба.

Недостатня нормалізація сертифіката № АЛТ свідчіть про ті, что лікування слід продовжуваті более трех курсів.

список літератури

1. роззяв В.Ф., Михайлова А.М., Лаврюкова С.Я. Різноманітність етіологічних та клінічніх форм вірусніх гепатітів. - Одеса: зволікати 1997. - С. 322-323.

2. Івахів О.Л., Качор В.О. ! Застосування циклоферону при Гостра гепатіті С // У зб .: Мат. наук.-практ. конф. и пленуму Асоціації інфекціоністів України. - Тернопіль, 2001. - С. 212-213.

3. Малий В.П., Пеньков Д.Б. Циклоферон у терапії Гостра та хронічніх форм гепатиту С // У зб .: Мат. наук.-практ. конф. и пленуму Асоціації інфекціоністів України. - Тернопіль, 2001. - С. 235-236.

4. Абдулмеджідова А.Г, Лакіна Є.І., Масалова О.В. Вивчення структурних та неструктурних білків вірусу гепатиту С (ВГС) в клітинах печінки пацієнтів з хронічним гепатитом С // "Гепатит С (Російський консенсус)". - 2000. - № 6. - С. 65-67.

5. Афанасьєв А.Ю., Зубов С.В., Жданов Ю.Є. ІФА-діагностика в розмежуванні гепатиту С гострого і хронічного перебігу // Росс. журн. гастроентер., колопрокт. - 1995. - Т. 5, № 3. - С.12.

6. Букринская А.Г., Жданов В.М. Молекулярні основи патогенності вірусів. - М .: Медицина, 1986, - 249 с.

7. Григор'єв Н., Яковенко Е. Хронічні вірусні гепатити. // Медична газета. - 1995. - № 3, С. 8-9.

8. Григорян С.С, Іванова AM, Єршов Ф.І. Противірусна активність "Аміксину" і його вплив на інтерфероновий статус при гепатиті у мишей. // Зап. Вірусологіі.-1990, №2.-С.138-140.

9. Григорян С.С, Єршов Ф.І. Клінічна ефективність індукторів інтерферону / Сучасні аспекти застосування інтерферонов.-1990 С24.

10. Григорян С.С, Іванова AM, Ходжаєв Ш.Х і ін. Інтерферон индуцированная активність "Аміксину" і його вплив на інтерфероновий статус. // Зап. Вірусологіі.-1990, №1.-С.61-64.

11. Дідковський Н.А., Коваленко А.Л., Романцов М.Г. Корекція циклоферон імунодефіцитного стану / Лікуючий лікар. - № 5-6, 2000..

12. Ільїна Е.Н., Гущин А.Е., Говорун В.М. Нові перспективи генодиагностики у встановленні діагнозу та моніторингу вірусних гепатитів В і С. // 3-й Всеукраїнській науково-практичній конференція "генодіагностика в сучасній медицині": Тез. доп. - М .: Медицина, 2000. С. 216-218.

13. Ісаєва О.В., ГущінА.Е., Малишев BC Федеральна система зовнішнього контролю якості виявлення HBsAg, анти-ВГС і РНК ВГС: 1996-2001 годи. // IV Російської науково-практичної конференції, "Гепатит В, С і D - проблеми діагностики, лікування та профілактики": Тез. доп. - М .: Медицина, 2001. - С. 151-153.

14. Клаус Дж. Лімфоцити: методи // Пер. з англ М .: Мир, 1990.-396с.

15. Коротяев А.І., Бабічев С.А. Медична мікробіологія, імунологія та вірусологія. - СПб .: СпецЛит, 2000. - 591 с.

16. Кузин С.Н., Лисицина Є.В., Самохвалов Є.І. Поширення гепатиту С і окремих генотипів вірусу гепатиту С в регіоні з помірною активністю епідемічного процесу // Питання вірусології. - 1999. - № 2. - С. 79-82.

17. Лакіна Е. І., Самохвалов Є.І., Левченко О. Г. Виявлення позитивних (геномних) і негативних (реплікативних) ланцюгів РНК вірусу гепатиту С в сироватці крові, лімфоцитах і тканини печінки хворих на хронічний гепатит С за допомогою полімеразної ланцюгової реакції // Зап. вірусологія. - 2000. - № 4. - С. 37-41.

18. Львів Д.К. Вірусні гепатити. // Вісник Російської Академії медичних наук. 1996 року, №6, - С. 25-31.

19. Львів Д.К., Дерябін П.Г. Географічне Поширення вірусу гепатиту С і його генотипів. // Зап. вірусологія. - 1997. - № 5. - С. 196-199.

20. Львів Д.К., Мішіро С., Селіванов Н.А. Поширення генотипів вірусу гепатиту С, що циркулюють на територіях Північно-Західної і Центральної частин Росії .// Зап. вірусологія. - 1995. - № 6. - С. 251-253.

21. Масалова О.В., Самохвалов Є.І., Петракова Н.В. і ін. Виявлення маркерів вірусу гепатиту С - білка нуклеокапсида, РНК і вірус-специфічних антитіл в плазмах крові донорів // Зап. вірусологія. - 2000. - N2. - С. 14-18.

22. Моміналіев KT, Говорун В.М .. Перспективи застосування методів ДНК-діагностики в лабораторній службі // Клінічна лабораторна діагностика. - 2000. - № 4. - С. 25-32.

23. Мукомолов С.Л., Колобов А.А., Плотникова В.А. Використання методу серотипування для визначення генотипів вірусу гепатиту С, що циркулюють в Санкт-Петербурзі // Тез. міжнарод. Фальк. сімпоз. - 2001. - № 92. - С. 266.

24. Подимова С.Д .: Хвороби печінки. Керівництво для лікарів M .: Медицина, 1998. - 245 с.

25. Подимова С.Д., Рачвелішвілі Н.Б. Клінічна і прогностична значимість факторів клітинного імунітету у хворих на хронічні захворювання печінки .// Вестн. Росс. Акад. мед. наук.- 1994.- N5.- С.14-18.

26. Покровський В.І. Керівництво по епідеміології інфекційних хвороб. - М .: Медицина, 1993. - С. 104-292.

27. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Імунологія. Пер. з англ. - М .: Світ, 2000. - 592с.

28. Романцов М.Г. Застосування циклоферону в педіатричній практиці. - С.-Пб, 2000. - 64 с.

29. Сарінсон С.Н. Особливості патогенезу та перебігу гепатиту С. Оптимальні терміни лікування інтерфероном // Вірусні гепатити. - 1998. - №1. - С. 3-8.

30. Семененко Т.А. Клітинну імунну відповідь при гепатиті С. // Інформ. бюлетень. Вірусні гепатити. - 2000. - №1.- С.3-9.

31. Солдогуб Т., Мельникова Г., Романцов М., Коваленко А. Ефективність циклоферону при різних формах вірусного гепатиту // Лікар. - № 11, 1999. - С. 13-15.

32. Титов Л.П. Імунологія та иммунопатология вірусних гепатитів .// Матеріали першої міжнародної конференції з вірусним гепатитам. Мінск.- 1997. -С. 33-34

33. Фримель Г. Імунологічні методи .// Пер. з нім. к.м.н. А.П.Тарасова) .- М .: Медицина, 1987.- 472с.

34. Циклоферон в лікуванні захворювань інфекційної природи: Метод. рекомендації / А.А. Руденко, А.Д. Вовк, І.А. Боброва, Л.В. Муравская і співавт. - Київ, 2000. - 24 с.

35. Циклоферон в педіатричній практиці: Метод. рекомендації / Шостакович-Корецька Л.Р. - Дніпропетровськ, 2000. - 44 с.

36. Циклоферон: підсумки і перспективи клінічного застосування: Анотований збірник / Ф.І. Єршов, М.Г. Романцов, А.Л. Коваленко з співавт. - С.-Пб, 1999. - 80 с.

37. Чекнев С.Б. Недостатність системи інтерферону як механізм розвитку імунодефіциту з природничих кілерам // Імунологія .-- 1 993 .-- № 6 .-- С. 8-12.

38. Шахгильдян І.В. Сучасна епідеміологічна характеристика гепатитів В і С в Російській Федерації // Вірусні гепатити: досягнення і перспективи. - 1999 № 3. - С. 9-16.

39. Adier WH, Nagel JE: Clinical immunology and aging. Principles of Geriatric Medicine and Gerontology // New York, McGraw-Hill. - 1994. - № 5. -P. 61-75.

40. Bukh J., The hepatitis З virus // American Association for the Study of Liver Diseases Post-graduate Course. - 2000 № 6. - P. 102-111.

41. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. - 1989. - № 244. - Р. 359-62.

42. Dienstag JL, Isselbacher KJ Acute hepatitis // Harrisons Principles of Internal Medicine New York, McGraw-Hill. - 1994. - № 7. - P. 1458-1478.

43. Floreani A, Bertin T, Soffiati G. Are homes for the elderly still a risk area for HBV infection // Eur. J. Epidemiol. - 1992. - №. 8. - Р. 808-811.

44. Goodson JD, Taylor PA, Campion EW The clinical course of acute hepatitis in the elderly patient // Arch. Intern. Med. - 1992. - № 142. - Р. 1485-1488.

45. Hoofnagle JH, Carithers Jr RL, Shapiro C. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. // Hepatology. - 1995. - № 21. - Р. 240-252.

46. ​​Kato N, Ootsuyama Y, Tanaka T. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis З viruses // Vims. Res. - 1992. - № 22. - Р. 107-123.

47. Kondo Y, Tsukada K, Takeuchi T. High carrier rate after hepatitis В virus infection in the eld-erly // Hepatology. - 1993 - № 18. - Р. 768-774.

48. Laverdant С, Algayres JP, Daly JP Viral hepatitis in patients over 60 years of age: Clinical, etiologic and developmental aspects // Gastroenterol, Clin. Biol. - 1989. - № 13. - Р. 499-504.

49. Marcus EL, Dahoudi N, Tur-Kaspa R. Hepatitis З virus infection among elderly patients in a geriat-ric hospital // Arch. Gerontol. Geriatr. - 1994. - № 19. - Р. 213-221.

50. Prince AM, Huima-Byron T., Parker TS Visualization of hepatitis З virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral. Hepat. - l996. - № 3. - Р. 11-17.

51. SimorAE, Gordon M, Bishai FR: Prevalence of hepatitis В surface antigen, hepatitis З antibody, and H1V-1 antibody among residents of a long-term-care facility // J. Am. Geriatr. Soc. - 1992. - № 40. - Р. 218-220.

52. Sonnenblick M, Oren R, Tur-Kaspa R Non A, Non В hepatitis in the aged // Postgrad. Med. J. - 1990. - № 66. - Р. 462-464.

53. Yuasa T, Ishikawa G, Manabe S. The particle size of hepatitis З virus estimated by fil-tration through microporous regenerated cellulose fibre // J. Gen. Virol. - 1991. - № 72. - Р. 2021-2024.

...........



Скачати 89.07 Kb.