Стандартні препарати і ефекти матриксу






    Головна сторінка





Скачати 27.06 Kb.
Дата конвертації31.05.2018
Розмір27.06 Kb.
Типреферат

Стандартні препарати і ефекти матриксу


ВСТУП

У цій роботі обговорюється проблема приготування стандартів і матриксу, а також їх вплив на стандартизацію імуноаналізу. Стандартизація базується на застосуванні певних принципів і зазвичай включає в себе оцінку систематичних помилок, точності, відтворюваності і порівнянності даного методу з іншими. Незалежно від того, наскільки ускладнена або, навпаки, спрощена нова аналітична система, при її стандартизації повинні дотримуватися одні й ті ж принципи. Нерозуміння цих принципів та нехтування ними призводять до серйозних помилок.

Таким чином, в дану роботу включено такі питання: 1) проблеми, пов'язані з так званим матриксних ефектом; 2) інші фактори, іноді помилково приписувані матріксиому ефекту; 3) наслідки заміни одного міжнародного стандарту на інший; 4) обмеження при використанні моноклональних антитіл; 5) проблеми приготування контрольних матриксов для гаптенов; 6) деякі нові і розробляються стандарти Національного інституту біологічних стандартів і контролю (NIBSC).

Стандартизація імуноаналізу необхідна для 1) поліпшення точності діагнозу і моніторингу захворювань; 2) вибору загальних критеріїв для діагнозу захворювань; 3) можливості прямого порівняння ефективності різних імунодіагностичних наборів.

Перш ніж перейти до обговорення зазначених питань, хотілося б звернутися з проханням до читачів прочитати даний розділ до кінця, яким би сухим і нудним він ні здався.


ПРОБЛЕМА матриксу

Різні способи порівняння свідчать, що зазвичай різні методи імуноаналізу дають добре узгоджуються між собою результати. Однак іноді результати визначення конкретного речовини за допомогою даного методу виходять за розумні межі. Наприклад, два роки тому в одній з країн застосування декількох готових наборів постійно призводило до суттєво відрізняється результатами визначення тиреотропного гормону (TSH) в плазмі. Представники компаній, що випускають ці набори, вирішили, що розбіжності в результатах аналізу могли виникнути через застосування різних за складом розчинів для розведення міжнародного стандарту. Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВООЗ) * було запропоновано розробити метод вивчення ефекту різних матриксов. Потім ВООЗ спільно з Міжнародною організацією клінічної хімії (IFCC) провела спеціальний симпозіум з даної проблеми, на якому були запропоновані шляхи поліпшення порівнянності результатів різних методів імуноаналізу.

Калібрування імунодіагностичних наборів. Для калібрування будь-якого набору для аналізу кожна фірма, що випускає такі набори, має систему первинних і вторинних стандартів. Первинний контрольний стандарт зазвичай складається з Алік-ось, взятих із серії разбавлений стандарту. Кожна аліквотах містить певну кількість визначається речовини і зберігається при дуже низькій температурі. Ці аліквоти використовуються для калібрування робочих стандартів, які в свою чергу застосовують для калібрування випускаються наборів. Обумовлений речовина в первинному стандарті може бути або відомим кількістю чистого хімічної сполуки, або полипептидом, зміст якого виражено в одиницях міжнародного біологічного стандарту, або препаратом, каліброваним з даного пептиду. Для розведення стандарту часто використовують сироватки, буферні розчини і розчини, що містять білок-носій. Склад цих розчинів, або, як їх ще називають, матриксов, може впливати на реакцію антиген - антитіло, в результаті чого і з'являються систематичні помилки і мінливість результатів аналізу. Це явище називають "матриксних ефектом". Принцип сумісності аналізів полягає в тому, щоб аналізоване речовина в пробі взаємодіяв в тих же умовах, що і в стандартному розчині. Молекулярне оточення визначається речовини в обох розчинах має бути ідентичним або дуже близьким за складом; тільки тоді можна точно визначити його концентрацію. Визначення більшості речовин проводиться в сироватці, і, без сумніву, матриксні ефекти пов'язані з типом і способом обробки матеріалу, що використовується для розведення стандартів. Ясно, що такий матриксний ефект відмінний від ефектів, обумовлених прис> гствіем аутоантитіл, лікарських препаратів, пухлинних клітин або незвично високих концентрацій попередників або метаболітів визначається речовини.

Матриксні ефекти найчастіше впливають на визначення ти-реотропіна (TSH), загального тироксину (Л4), загального трііодотіро-нина (З), пролактину, фолікулостимулюючого гормону (FSH), лютеїнізуючого гормону (LH) і стероїдів (кортизолу, прогестерону і тестостерону, якщо вони попередньо не виділені з проби екстракцією).

Інші можливі джерела систематичних помилок. Інші пов'язані з проблемами стандартизації причини розбіжностей в результатах аналізу можуть бути обумовлені 1) відмінностями в молекулярній структурі визначається речовини або речовин в пробі і стандартному розчині (по суті справи, в цьому випадку порівнюються різні сполуки); 2) відмінностями в складі, способі зберігання і стабільності стандартів, які використовуються фірмами-постачальниками в якості первинного і робочого стандартів, а також стандарту для наборів; 3) систематичними помилками, пов'язаними з різною специфічністю аналізу на кожній стадії калібрування; 4) помилками при технічних операціях (наприклад, при розведенні розчинів), а також невдалої оптимізації умов аналізу, особливо при поділі вільного і пов'язаного з антитілами речовини.

Відмінності в молекулярній структурі чистих хімічних сполук можуть бути обумовлені присутністю ізомерів, зв'язування яких з білками плазми може відбуватися інакше, ніж у гаптенов, що володіють тільки нативной просторовою конфігурацією. В цьому випадку при приготуванні стандартів не допомагає і додавання екзогенного стероїду до сироватці. Крім того, ставлення пов'язаного з білком і вільного визначається речовини може змінюватися в залежності від умов аналізу, наприклад рН або іонної сили. Нарешті, невеликі відмінності в методах виділення визначається речовини з фізіологічних рідин можуть бути джерелами розкиду і систематичної помилки результатів аналізу.

Молекулярна гетерогенність стандартів. ВООЗ встановлено міжнародні стандарти, контрольні препарати або контрольні реагенти для двох груп складних біологічних сполук: 1) з'єднань (наприклад, пептидних гормонів), які можна очистити і визначити кількісно за допомогою біологічних аналізів; 2) речовин (наприклад, феритину або субодиниць глікопротеїнових гормонів), які в даний час можна визначити тільки по їх імунологічної активності.

Міжнародні стандарти для з'єднань першої групи зазвичай містять препарати очищеного гормону і білок-носій. Такий склад стандартів дозволяє охарактеризувати їх за допомогою як певних методів біоаналіза invivoілі invitro, так і фізико-хімічних методів. Ці методи використовуються для ідентифікації та кількісного визначення таких речовин [1].

Іншою причиною невідповідності між стандартами є природна гетерогенність молекулярної структури, яка найбільш часто спостерігається в разі глікопротеїнових гормонів (TSH, FSH, LH), а також пролактину і гормону росту. Зміст ізогормонов змінюється в залежності від джерела і способу отримання.

Молекулярна структура визначається речовини може змінюватися при ліофілізації, яка майже завжди включається в методики приготування міжнародних і більшості вторинних стандартів. Такі зміни можна виявити і оцінити кількісно за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) і ізоелектричного фокусування. Можна виділити два звичайних типу денатурації: 1) необоротна деформація молекули білка через пересушування; 2) утворення комплексів між пептидом і носієм, наприклад лактозою, Манні-те і трёгалозой.

І нарешті, не менш важливим фактором є власна нестабільність визначається речовини в стандарті. Причина, природа і ступінь змін структури багатьох складних білків (дезаминирование, окислення, зміна конформації), які відбуваються при їх зберіганні, дуже мало або зовсім не вивчені, а часто просто ігноруються.

У імуноаналізі стандарт зазвичай розчиняють або розбавляють матриксом, аналогічним тому, в якому розчинена проба, що містить визначувану речовину.

Матрикс. Для різних визначених речовин в якості матриксов використовують різноманітні матеріали, причому їх склад залежить від виробника. Найбільш часто використовувані матриксу включають цільну сироватку або плазму людини, містять визначається речовина в фізіологічних або патологічно низьких концентраціях. Іноді матриксу отримують зі свіжої крові, але набагато частіше для цього використовують препарати плазми людини, які вже непридатні для трансфузии. Крім того, в якості матриксов застосовують сироватки тварин і препарати альбуміну людини або тварин.

Перед використанням матриксу, особливо сироватки, повинні бути перевірені на патогени, наприклад, на поверхневий антиген вірусу гепатиту, а також відповідним чином оброблені з метою видалення або зниження до мінімуму змісту визначається речовини. Для цих цілей використовують обробку антитілами, активованим вугіллям, силікагелем та іонообмінними смолами. Деякі з цих методів і реагентів дають погано відтворювані результати; наприклад, різні партії активованого вугілля мають різні адсорбційні характеристики. Більшість методів, розроблених для видалення визначається речовини з сироватки в промисловому масштабі, зберігається в секреті.

Стандартизація матриксних ефектів. Для поліпшення порівнянності результатів, отриманих за допомогою різних методів імуноаналізу, ВООЗ було запропоновано постачати загальний контрольний матрикс для використання з певними міжнародними стандартами. Такий матрикс міг би випускатися у вигляді ампул з ліофілізований цільної сироваткою, обробленої відповідним чином для видалення з неї визначається речовини. Будь-який використовується для обробки метод повинен точно відтворюватися при отриманні наступних партій, а технологія всього процесу повинна бути детально описана і опублікована. Ампули з таким матеріалом, який докладно охарактеризовано в незалежних дослідженнях і офіційно схвалений ВООЗ, потім поставлялися б разом з відповідними стандартами.

Однак реалізація такої програми передбачає виконання величезного обсягу наукової, організаційної та практичної роботи і відповідні витрати. Фактично витрати на введення міжнародного стандарту при цьому повинні були б подвоїтися. Відповідні пропозиції були поширені ВООЗ в 1985 р для з'ясування думки вчених, фірм - виробників наборів і національних органів контролю [2]. Спектр надійшли відгуків був дуже широкий, починаючи від повної підтримки ідеї введення контрольного матриксу фірмами, що випускають набори, до прямо протилежної точки зору, згідно з якою всі проблеми ефекту матриксу можуть бути вирішені за допомогою відповідної оптимізації методу аналізу.

Спільні дослідження. Зрештою було вирішено підтримати ідею перевірки і отримання експериментальних доказів того, наскільки введення загального матриксу поліпшило б відповідність результатів аналізів. Для цієї мети була створена спільна робоча група ВООЗ і IFCC, в завдання якої входило з'ясування впливу двох різних матеріалів, використовуваних в якості матриксу при аналізі TSH. Вибір цього гормону був обумовлений тим, що його визначення має бути якомога більш точним і чутливим для отримання необхідної в клінічній практиці інформації. Крім того, препарати TSH гетерогенні, нестабільні і важко піддаються стандартизації.

Отримання сироватки з низькими концентраціями TSH являє собою складну проблему, оскільки її отримують лише від хворих, що страждають певними видами тиреоїдної аденоми.В набагато більших кількостях таку сироватку можна отримати від здорових людей, у яких їх власна тиреоидная функція була пригнічена введенням Тз протягом декількох днів. Останні розробки пропонують ще більш простий спосіб отримання матриксу шляхом обробки вже непридатною для клінічного застосування плазми з банку крові за допомогою лектинів, які адсорбують ендогенний TSH. В даний час проводяться спільні експерименти з першими двома типами сироваток. Отримані результати і висновки будуть представлені в Експертний комітет ВООЗ з біологічної стандартизації.

ВПЛИВ ОНОВЛЕННЯ МІЖНАРОДНИХ СТАНДАРТІВ

Перші стандарти для науково-дослідних робіт. Зараз ясно, що науково-дослідні роботи в області імуноаналізу розвивалися настільки швидкими темпами за рахунок введення загального стандартного матеріалу на самих ранніх етапах досліджень. Завдяки цьому лабораторії забезпечувалися досить хорошими стандартними препаратами при розробці методів очищення і кількісного визначення. У 60-х рр. Відділ біологічних стандартів Національного інституту медичних досліджень (NIMR) ввів науково-дослідні стандарти для ряду речовин (кальцитонін свині, еритропоетин, гіпофізарні гормони людини FSH, LH, TSH, GH, пролактин). Скоро стало очевидним, що зіставлення якісних і кількісних даних сильно полегшується, якщо для порівняння використаний один і той же стандартний препарат. Згодом деякі з науково-дослідних стандартів NIMR були прийняті Експертним комітетом ВООЗ по біологічним стандартам в якості міжнародних. Крім того, система одиниць, яка використовується в науково-дослідних стандартах, була прийнята за основу при розробці застосовуються зараз міжнародних одиниць.

Вибір відповідного матеріалу. Однією з перших проблем при введенні науково-дослідних стандартів став вибір відповідного матеріалу. На ранніх етапах дослідження молекулярна структура речовини часто взагалі або майже невідома. В цьому випадку зазвичай використовують той доступний матеріал, який в рамках наявної про нього інформації вважається найбільш підходящим. Дуже часто доводиться використовувати грубий неочищений екстракт або навіть необроблені і нефракці-онірованние фізіологічні рідини, наприклад сироватки. У разі ряду речовин, наприклад гормонів, які ідентифікують на перших стадіях дослідження по їх біологічної активності, вихідний матеріал, який використовується для приготування стандарту, зазвичай являє собою концентрований екстракт, придатний для характеристики гормону і застосування в біоаналіза invivo. Якщо ж невідома відповідна біологічна функція, придатна для контролю визначаються речовин (такі, наприклад, неактивні попередники або метаболіти), то найбільш розумним буде використання індивідуальної або змішаної сироватки.

Заміна некоректних стандартів. Впровадження науково-дослідних стандартів може супроводжуватися низкою труднощів. Даний матеріал може виявитися непридатним для стандарту найчастіше в силу того, що він містить або визначається речовина в денатурованому вигляді, або його попередники і метаболіти, або інші речовини, досить близькі за молекулярною структурою, в таких кількостях, які можуть перешкодити протіканню імунологічної реакції. Якщо такі факти точно встановлені, необхідно замінити "невідповідний" стандарт на інший, що складається з можливості з найбільш чистого препарату, наявного в розпорядженні. Слід підкреслити, що стандарт є тільки "робочою гіпотезою матеріалу". Це всього лише препарат, який, за наявними в даний час даними, можна використовувати для коректного кількісного визначення даної речовини. У будь-який момент у світлі нових наукових даних цей стандарт може виявитися невідповідним


Заміна "брудних" стандартів. Дуже часто не розуміють значення і причин заміни одного стандарту на інший, більш високого ступеня чистоти. Якщо змінюється міжнародний стандарт, то наслідки нерозуміння причин такої заміни можуть проникнути в національне законодавство, промисловість і клінічну практику. Тому дуже важливо чітко уявляти собі, чому замінений даний стандарт і що в цьому випадку слід робити.

~ Розглянемо перший стандарт, в даній кількості якого (масі, вмісті ампули) міститься х молекул речовини А і деяку кількість молекул, подібних по ряду властивостей (наприклад, иммунореактивности) з речовиною А. Цей стандарт замінюють на інший, що містить подвійну кількість 2х (на мг або на ампулу) чистого речовини А. коли другий стандарт аналізують за допомогою методу, специфічного до А (тобто коли визначається тільки А), то результати аналізу повинні Показати подвоєне вміст А в другому стандарті по відношенню до першого стандарт . Якщо ж другий стандарт аналізують за допомогою методу, в якому взаємодіють і домішки, подібні А, і знаходяться в першому стандарті, то кількість речовини А в другому стандарті за даними цього аналізу буде менше'с. Ступінь заниження результатів залежить від специфічності даного аналізу. Ця проблема описана в роботі [3] і проілюстрована на рис. 2.1. Як зазначав професор Фіняі, важлива не стільки математика біологічної стандартизації, скільки розуміння лежать в її основі принципів.

Наслідки впровадження міжнародного стандартного препарату (МСП) для визначення хоріонічного гону-дотропінамі людини. Яскравим прикладом того, які непорозуміння можуть виникнути при заміні "брудного" міжнародного стандарту на інший, що містить більш чистий матеріал, є ситуація, що виникла в ході впровадження другого міжнародного стандарту (МО хоріонічного гонадотропіну людини (hCG) для калібрування міжнародного стандартного препарату (МСП), призначеного для імуноаналізу hCG. Визначення hCG в сироватці крові або в сечі використовують для діагностики ранніх стадій вагітності. Природно, чим більше чутливий тест, тим раніше він дасть покладіть ний сигнал. При перекалібровка різних продажних наборів по новому МСП в тих наборах, в яких відбувалося неспецифічне взаємодія з численними домішками, що містяться в 2-му МС (а- і / 5 субодиниці, денатуровані форми hCG), довелося міняти градуювання стандартів, що входять в-набори. в результаті такої заміни погіршилася справжня чутливість визначення майже всіх наборів. Наслідки виявилися вельми неприємними, оскільки довелося давати пояснення медикам і споживачам наборів. Такі пояснення були опубліковані [4, 5]. Коректність нового МСП була підтверджена за допомогою специфічних моноклональних антитіл [6]. Цей приклад не є єдиним. Подібна ситуація може виникнути зараз після введення в 1986 р нового міжнародного стандарту для FSH; перекалібровка відповідних іммуноаналітіческіх наборів (в деяких випадках в 5 разів), по-видимому, зустрінеться з тими ж труднощами, що й у випадку hCG.

Перший міжнародний стандарт для гіпофізарой-ного FSH. Зважаючи на важливість визначення гіпофізарного і сироваткового FSH перший міжнародний стандарт і другий МСП були введені саме для цих гормонів (МСП також для LH). Ці МСП були приготовлені професором Рейчерт в лабораторії професора Вильгельми шляхом екстракції гіпофізів, що зберігалися в ацетоні. Оригінальний вихідний матеріал відомий в Америці під шифром LER 907. Частина цього матеріалу була ліофілізо-вана в ампулах (код 69/104) у Відділі біологічних стандартів NIMR і надалі була використана в якості науково-дослідного стандарту. Отриманий препарат був прийнятий ВООЗ в 1.973 р в якості МСП для біоаналіза гіпофізарних FSH і LH [7]. Коли перша серія ампул (близько 3500 штук) була витрачена, в якості другого МСП для біоаналіза FSH і LH стали використовувати нову серію (код 78/549), також отриману з LER 907. Хоча різні аліквоти одного і того ж матеріалу були оброблені аналогічним чином [8], не можна стверджувати, що за складом LER 907, 69/104 і 78/549 ідентичні, оскільки невідомо, які молекулярні зміни відбулися в зразках в процесі зберігання і ліофілізації.

Починаючи з 1973 р були проведені численні дослідження з вивчення властивостей гипофизарного FSH і введенню чистого стандарту. Ця робота була пророблена професором Е.Дізфалу-сі, Д.Робертсон і А.Завді в Каролінському інституті в Стокгольмі і професором П.Сторрінгом у Відділі ендокринології Національного інституту біологічних стандартів і контролю (NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl, NIBSC) в Лондоні. За допомогою елегантних і детальних експериментів були виявлені ізогормони, сильно розрізняються за своєю біологічною активністю [9, 10]. Незважаючи на гетерогенність гормону, було прийнято рішення в якості нового стандарту використовувати суміш цих глікопротеїдів. Відповідно до правил Експертного комітету ВООЗ з біологічної стандартизації як стандарт був обраний екстракт, що володіє найвищою фол-лікулостімулірующей активністю invivo. Відповідний тест заснований на визначенні збільшення маси яєчників у групі статевонезрілих щурів, які отримували певні дози FSH і надлишок LH протягом 4-5 днів.

Був обраний і ліофілізований в ампулах кращий зразок. Після попередньої перевірки новий стандарт був калібрувати проти МСП для біоаналіза гіпофізарних FSH і LH 27 групами вчених в 13 країнах. Експерименти включали також використання ряду інших каліброваних матеріалів, в тому числі і відповідних сироваток.

2.3.7. Введення одиниці міжнародного стандарту FSH. Експерименти по стандартизації нового препарату гипофизарного FSH були сплановані і виконані д-ром Сторрінгом і д-ром Дас. Отримані результати, які пізніше будуть опубліковані повністю, можна віднести до однієї з трьох груп: 1) близько 80 м.ед. FSH на ампулу при біоаналіза invivo; 2) близько 30 м.ед. FSH на ампулу при біоаналіза invitroі в рецепторном тесті; 3) близько 16 м.ед. FSH на ампулу з даними різних видів їм-муноаналіза.

Який же тип аналізу повинен бути взятий за основу для введення нового стандарту? Згідно з рекомендаціями ВООЗ, це повинен бути біоаналіза invivo, оскільки це єдина відома система, в якій сіалілірованние і глікозильовані ізогормони FSH, а також їх метаболіти оцінюються по фізіологічному ефекту на інтактні клітини insitu. З іншого боку, можна стверджувати, що біоаналіза invitroі рецепторний тест дозволяють визначити кількість активного гормону точніше, проте отримані результати сильно залежать від якості ізольованих тканин, клітин і рецепторів, які в процесі обробки можуть модифікуватися, наприклад, ферментами. Крім того, дані методи не відображають природні міжклітинні взаємодії і занадто нетривалі за часом, щоб зафіксувати інші медленнр проявляються ефекти активності FSH. Нижчі результати імуноаналізу можна пояснити перехресними реакціями антитіл з іншими гликопротеинами і домішками, що містяться в МСП гіпофізарних FSH і LH.

Слід пам'ятати, що біоаналіза гормонів invivoшіроко використовується і добре описаний в науковій літературі і посібниках з фармакології. Одні і ті ж лінії щурів і мишей є в багатьох лабораторіях світу, тому наблюда £ й <г *, реакція пов'язана тільки з біологічною активністю гормону. У разі ж імуноаналізу використовувані реагенти сильно розрізняються за складом. і мають обмежений час життя. Характеристики кожної системи аналізу рідко бувають детально задокументовані, і спостерігаються коливання результатів '(наприклад, частка пов'язаної мітки), як правило, не пов'язані з біологічною активністю гормону.

Оскільки новий стандарт повинен представляти активний FSH, то величина 80 м.ед. на ампулу здається найбільш обгрунтованою. Більшість учасників міжнародних випробувань погодилися з цим висновком, і пізніше Експертний комітет ВООЗ по біологічним стандартам затвердив матеріал з кодом 83/575 в якості третьої міжнародного стандарту FSH з вмістом 80 м.ед. на ампулу.

2.3.8. Наслідки введення нового МС. Рішення прийняти величину 80 м.ед. FSH на ампулу в якості третьої междуна- / рідного стандарту має далекосяжні наслідки як для фірм, що випускають відповідні набори, так і для клініцистів. Першим доведеться перекалібрувати їх власні стандарти і набори, а також переоцінити специфічність аналізу. У клінічній хімії необхідно провести велику навчальну та роз'яснювальну роботу. Наприклад, величина відносини LH / FSH, часто використовується при діагнозі полікістозу яєчника, після введення нового стандарту зміниться. Ясно, що введення нового МС потребує багато часу. У перехідний період було запропоновано використовувати обидва стандарти, проте виробникам і споживачам наборів і редакторам періодичних наукових журналів рекомендувалося вказувати, який стандарт в кожному випадку використовували при визначенні FSrf. Такий підхід був прийнятий після введення очищеного МСП для hCG, і можна сподіватися, що він згладить незручності перехідного періоду як для постачальників, так і для клініцистів.

Після прийняття більш чистого стандарту для FSH повинні бути введені і стандарти для субодиниць або подібних FSH речовин, якщо буде доведено, що їх визначення становить практичний інтерес. При необхідності будуть введені міжнародні стандарти і для ізольованих а- і / 3-субодиниць FSH.

У цій роботі процедурі заміни міжнародних стандартів було приділено багато уваги, оскільки, на думку автора, дуже часто заміна стандартів викликає непорозуміння тільки тому, що не зрозумілі важливість і сутність цього процесу.

ТЕХНОЛОГІЯ РЕХОМБІНАНТНИХ ДНК

В останні роки для великомасштабного отримання важкодоступних пептидів все більш широке поширення набувають методи генної інженерії (технології рекомбінантних ДНК). Деякі з білків (інсулін, гормон росту), отриманих цим методом, абсолютно ідентичні природним білкам людини. Інші речовини, наприклад глікопротеїн еритропоетин, ідентичні нативним речовин за структурою поліпептидного ланцюга, але трохи відрізняються від них за будовою бічних вуглеводних ланцюгів в залежності від продукує лінії тварин клітин. Отримання білків і деяких глікопротеїнів в якості стандартів генно-інженерним шляхом найзручніше в разі важкодоступних об'єктів (інтерлейкіни laі / ?, ренін, інтерферони людини). Проблеми контролю виробництва та детального дослідження властивостей рекомбінантних продуктів розглянуті в роботах [П, 12].

ЗАСТОСУВАННЯ моноклональних антитіл

Застосування моноклональних антитіл для йммуноаналіза пептидів вимагає великої обережності, оскільки високоспецифічні моноклональні антитіла можуть взаємодіяти, наприклад, тільки з одним з ізогормонов. З цих же причин не можна використовувати "занадто" специфічні моноклональні антитіла і для афінної очистки пептидів. Крім того, існує небезпека руйнування зразка при його Елюювання з афінної колонки під дією рН і іонної сили розчину. І нарешті, слідові кількості антитіл можуть забруднювати очищений продукт і впливати на результати аналізу.

Приготування СТАНДАРТНИХ ПРЕПАРАТІВ гаптенами

Високоочищені стандартні препарати гаптенов можна отримати від виробляють їх фірм і з деяких некомерційних джерел, наприклад з колекції стандартів стероїдів Медичного науково-дослідного центру. Багато гаптени (наприклад, певні гормони і ліки) досить погано і з різною аффинностью зв'язуються з білками крові, тому частково (зазвичай <5%) вони знаходяться у вільному вигляді. Раніше імуноаналізу багатьох гаптенов передувало їх виділення екстракцією. Останнім часом інтенсивно розробляються методи визначення сумарної кількості певного гаптена в сироватці або плазмі без його виділення. Крім того; розроблений прямий розділовий метод для визначення не пов'язаного з білками вільного гаптена (наприклад, вільного Т4) в сироватці. Ці Розробки включають створення і калібрування відповідних матриксов, склад яких є комерційним секретом. Мабуть, отримання ідеального матриксу, придатного для вирішення будь-якої фізіологічної або патологічної завдання, є недосяжною метою.


  • ПРОБЛЕМА матриксу
  • ТЕХНОЛОГІЯ РЕХОМБІНАНТНИХ
  • ЗАСТОСУВАННЯ моноклональних антитіл
  • Приготування СТАНДАРТНИХ ПРЕПАРАТІВ гаптенами

  • Скачати 27.06 Kb.