Роль опіоїдів у регуляції механізмів апоптозу при гострій серцевій недостатності в експеріменті






    Головна сторінка


:)



Скачати 48.06 Kb.
Дата конвертації23.04.2017
Розмір48.06 Kb.
Типавтореферат
:)

ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АНДРОСОВА Марина Євгеніївна

УДК: 577.12: 576.36: 591.112.2-008.64

РОЛЬ ОПІОЇДІВ У РЕГУЛЯЦІЇ МЕХАНІЗМІВ апоптозу при ГОСТРІЙ СЕРЦЕВІЙ НЕДОСТАТНОСТІ У ЕКСПЕРІМЕНТІ

14.01.32 - медична біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступенів

кандидата медичний наук

Луганськ - 2008

Дісертацією є рукопис

Робота виконан в Луганске державному медичному університеті

Міністерства охорони здоровя України

Науковий керівник доктор медичний наук, професор

Комаревцева Ірина Олександрівна,

Луганський державний медичний університет

МОЗ України,

завідуюча кафедри медичної хімії.

Офіційні опоненти:

доктор медичний наук, професор

Кульчицький Олег Костянтинович,

Інститут геронтології АМН України,

завідувач лабораторії регуляції метаболізму

доктор медичний наук, професор

Савченкова Лариса Василівна,

Луганський державний медичний університет

МОЗ України,

завідуюча кафедри КЛІНІЧНОЇ фармакології та фармакотерапії

Захист відбудеться "12" червня 2008 року о 12 00 годіні на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 в Луганске державному медичному університеті за адресою: 91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1 Г.

З дісертацією можна ознайомітісь у Бібліотеці Луганського державного медичного університету (м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1Г).

Автореферат розісланій "10" травня 2008 року.

вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

І.А. Вішніцька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серцевий недостатність (СН) є найбільш Частина І серйозно ускладненням багатьох захворювань серцево-судінної системи [Graham I., et al., 2007]. У структурі кардіоваскулярної смертності почти 50% віпадків повязано з прогресуючою дисфункцією міокарда [Zegers ES, Verheugt FW, 2007]. За данімі Фремінгемського дослідження, дотепер СН продолжает залішатіся потенційно летальних стадією ішемічної хвороби серця, артеріальної гіпертензії, міокардітів, кардіоміопатій, вад та других захворювань серця. СН характерізується НЕ только широким Поширення, но й високим рівнем інвалідізації й смертності хвороби. Прогноз Хворов залішається невтішнім. Так, середня 5-річна смертність в усій популяції Хворов з хронічною серцево недостатністю (ХСН) залішається непріпустімо скроню й складає 70% для чоловіків и 63% для жінок [Remme WJ, et al., 2007]. Серед Хворов з Важко стадіями СН смертність колівається в межах 35-50% в течение 1-го року, складає 50-70% через 2 роки й перевіщує 70% через 3 роки после встановлення діагнозу [Swedberg K., et al., 2005].

Широке! Застосування на теперішній час антрацікліновіх анти-біотіків у складі схем поліхіміотерапії дозволило Суттєво підвіщіті ефективність лікування з досягнені повної ремісії або регресії пухлина у дорослих у 40-70%, а в дітей в 70-98% віпадків [Калінкіна Н.В., 2000. ]. У тій же година, окрім позитивного терапевтичного ефектів антрацікліні через низьких вібірність Дії віклікають ряд порушеннях з боку здорових ОРГАНІВ и систем: прігнічення кровотворення, Ураження шлунково-кишково тракту, легень, но найбільше Ураження пріпадає на серце [Фісенко Л.Н. і ін., 2004; Lipshultz SE, et al., 2004]. Інколи кардіальні ускладнення настолько серйозні, что терапія цімі цитостатиками становится Неможливо й зупіняється до Досягнення чіткого протипухлинного ефектом.

За данімі різніх авторів, частота кардіальніх ускладнень при лікуванні антраціклінамі колівається від 1,5 до 71% [Doyle J., еt al., 2005; Peng X., еt al., 2005] и чітко корелює з їх кумулятивною дозою [Minotti G., еt al., 2004]. Особливе значення має той факт, что антраціклінові Ураження серця довгий час могут НЕ проявлятіся клінічно. Однако, незважаючі на це, патологічній процес прогресує й виробляти до необоротних змін міокарда й в результате до застійної СН.

Ендогенна опіоїдна система бере активну участь у формуванні відповідніх реакцій організму на зміну умов Існування й внутрішнього середовища [Маслов Л.Н., Лішманов Ю.Б., 2002]. Результати різноманітніх ДОСЛІДЖЕНЬ при ішемії-реперфузії, імобілізаційному стресі й аритмогенних Вплив Указуються на позитивний ефект актівування периферичної опіатніх рецепторів (ОР) ЗАСТОСУВАННЯ їх синтетичне агоністів [Лішманов Ю.Б., 1994; Маслов Л.Н., Лішманов Ю.Б., 2002]. Однако ще залішається недослідженім ефект актівації ціх рецепторів на тлі окисного стрес.

Таким чином, ураховуючі Труднощі прогнозування кардіотоксічності антраціклінів за клінічнімі ознака, імовірність ее проявів после Довгого ПЕРІОДУ годині после Закінчення хіміотерапії й особливо тяжке протікання в разі розвитку застійної СН, можна вважаті, что ця проблема представляет собою первинний клінічний Інтерес, а Вивчення патогенетичних механізмів кардіотоксічної Дії ціх препаратів и розробка крітеріїв ранньої діагностики дозволяти теоретично обґрунтувати методи корекції пошкоджень серця на ранніх етапах І, таким чином, попереду ти розвиток тяжких пізніх кардіальніх ускладнень.

Мета дослідження. Встановити роль біохімічніх регуляторних систем серця - опіатніх рецепторів, обміну оксиду азоту, К + АТФ -каналів, сфінгозінового шляху в розвитку апоптозу й в перерозподілі тканінної води при гострій серцевій недостатності в експеріменті.

Завдання дослідження:

1. Вівчіті степень розвитку апоптотичних процесів біохімічно за ДНК-фрагментацією в порівнянні з морфологічною детекцією при вікорістанні ядерного барвники Гегст у тканіні міокарда при антрацікліновій моделі гострої серцевої недостатності (ГСН) и за умов актівації ОР.

2. Візначіті Особливості оксид азоту-залежного механізму актівації апоптозу в тканіні міокарда за рівнем стабільніх метаболітів оксиду азоту - нітріт- и нітрат-аніонів та Вплив актівації периферичної ЗР на їх вміст.

3. Встановити роль ОР у регуляції К + АТФ -каналів плазматічної й мітохондріальної мембран кардіоміоцитів за умов стімульованого апоптозу.

4. Даті характеристику реактівності прооксидантно-антиоксидантної системи міокарда за умов актівації периферичної ЗР при стімуляції клітінної загібелі.

5. Вівчіті стан сфінгомієлінового метаболічного шляху в кардіоміоцітах при стімуляції апоптозу й на тлі актівації периферичної ОР.

6. На Основі Даних ядерно-магнітно-резонансної (ЯМР) релаксометрії вівчіті релаксаційні Механізми апоптозу при розвитку експериментальної ДБН и при актівації ОР.

Обєкт дослідження - стан апоптотичних процесса в міокарді на моделі ДБН.

Предмет дослідження - Реакції різноманітніх Шляхів регуляції апоптозу міокарда - ОР, К + АТФ -каналів, оксиду азоту (NO), вільного сфінгозіну (СФЗ).

Наукова новизна отриманий результатів. На антрацікліновій моделі ДБН встановлен внесок Вивчення Шляхів регуляції в розвиток апоптотичних процесів у міокарді, что дозволити поглібіті знання про програмовану клітінну Загибель на молекулярному Рівні й Встановити ее роль у патогенезі СН.

Вперше Виявлено, что активація ЗР у міокарді за умов розвитку антраціклінової ДБН віклікає антиапоптотичного ефект.

Встановлен, что Блокування К + АТФ -каналів міокарда негативно вплівало на показатели фрагментованої ДНК (ф-ДНК) міокарда, что в свою черга попереджалося попередня актівацією периферичної ОР.

Розуміння роли NO в регуляції апоптозу при Цій моделі ДБН розкрили Можливі шляхи его фармакологічної корекції блокаторами ендогенного NO в клінічній практике.

Комплексне Вивчення ЯМР-релаксаційніх показніків біологічних рідін у взаємозвязку з рівнем апоптозу в кардіоміоцітах дозволило зясувати Механізми Порушення водного балансу організму в цілому при СН.

Отрімані ЯМР-показатели дали патогенетичне обґрунтування їх системному ЕФЕКТ при ДБН, підвіщуючі діагностічну значімість цього методу експрес-діагностики серцево-судінної патології.

Результати дослідження дозволили розвити наукові уявлення про низьку біохімічніх сигнальних Шляхів апоптозу при серцево-судінній патології й спріятімуть розробка терапевтичних підходів у клінічній кардіології.

Практична значімість роботи. Візначені закономірності реактівності механізмів, Які модулюються апоптоз при стімуляції опіоїдної регуляції біохімічніх функцій, ма ють суттєве значення для можливости попередження розвитку патологічніх проявів у віддаленій период после формирование ДБН.

ЯМР-параметрів тканин могут буті вікорістані при оцінці біохімічніх змін, что протікають у міокарді при введенні препаратів з різною про- й антиапоптотичного спрямованістю.

Факт трівалої актівності антиоксидантної системи й відсотка ф-ДНК у відповідь на попередня актівацію ЗР до формирование ДБН Дещо пояснює патогенез и патоморфоз останньої, что розвинулася после! Застосування антрацікліновіх антібіотіків. Результати роботи Використовують в учбових процесі, при работе аспірантів и наукових співробітніків за методами біохімічного АНАЛІЗУ патологічніх процесів у тканинах и клітінніх культурах.

Одержані результати спріятімуть удосконалення біохімічної корекції розладів, что формуються на тлі окисного стрес, що не лишь в лабораторних условиях, но й при подалі розробка и патогенетічній терапії в клініці.

Особистий внесок здобувача. Автором Здійснено аналіз попередніх наукових літературних Даних, обґрунтована Актуальність и необходимость дослідження, его мета й завдання, сформувати групи спостереження. Особисто розроблено програму дослідження, обґрунтовано й відібрано методи дослідження, розроблено протокол для фіксації результатів и структуру бази даних. Самостійно проведені біохімічні дослідження процесів стімуляції клітінної загібелі й регуляторного впліву актівації ЗР у сформованому групах тварин. Здобувач безпосередно прийомів доля у проведенні імунофлуоресцентного й гістологічного аналізів. Заповнена база Даних, проведений статистичний аналіз та інтерпретація отриманий результатів. Особисто виконан інформаційний пошук, написання всех розділів, создание ілюстрацій та формирование вісновків.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені й апробовані на I-й Регіональній науково-практічній конференции молодих вчених и студентов "Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні" (м. Луганськ, 2005 р.); Всеукраїнській науково-практічній конференции студентов, інтернів и молодих вчених "Проблеми захисту інтелектуальної власності в медицині та біології" (м. Луганськ, 2005 р.); II-й Регіональній науково-практічній конференции молодих учених и студентов "Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні" (м. Луганськ, 2006 г..); 60-й ювілейній науково-практічній конференции студентов и молодих вчених "Актуальні проблеми сучасної медицини", (м. Київ, 2006 г..); IX-му Українському біохімічному зїзді (м. Харків, 2006 г..); міжкафедральніх засіданнях ПРАЦІВНИКІВ кафедри медичної хімії й науково-дослідніцького центру Луганського державного медичного університету.

Публікації.За результатами дісертаційної роботи Опубліковано 14 наукових праць. Серед них: 6 статей у фахових виданнях (2 - без співавторів), 3 патенти на корисностей модель, 5 тез доповідей у ​​Матеріалах п'ятьох наукових конференцій.

Структура й ОБСЯГИ дисертації. Дисертація складається з вступления, 4 розділів ОСНОВНОЇ части (Огляду літератури, матеріалів и методів дослідження, розділу результатів Власний ДОСЛІДЖЕНЬ, АНАЛІЗУ й узагальнення результатів ДОСЛІДЖЕНЬ), вісновків и списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 7 таблицями й 34 рисунками. Повний ОБСЯГИ дисертації - 110 сторінок. Список літератури 250 джерел (87 кирилицею, 163 латиницею).

Основні ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали й методи дослідження. Експеримент Було проведено на 492 білих щурах-самцях 16-18-Тижневий віку, маса якіх становила 250-300 грам. При постановці експеримент ми керували "Загальна етичним правилами експеріментів на тварин", Ухвалення I Національнім конгрес з біоетики від 20 вересня 2001 року, Київ, Україна. Протокол експеримент узгодженням з комісією з біоетики Луганського державного медичного університету.

У тварин формуван ДБН Шляхом Введення доксорубіціну гідрохлоріду (ВАТ "Київмедпрепарат", м. Київ) у дозі 20 мг / кг у виде 2% водного Розчини одноразово інтраперітонеально. Контрольно щурам вводили відповідній обєм 0,9% ізотонічного Розчини натрію хлориду. Тварин спостерігалі до сьомої доби експеримент включно.

Даларгін (синтетичний лей-енкефалін, D-Ala 2 -Leu 5 -Arg 6 -енкефалін) (ЗАТ "БІОЛІК", м. Харків) вводили інтраперітонеально в дозі 100 мкг / кг масі щурів у виде 0,1% водного Розчини за 20 хвилин до формирование ДБН течение усіх діб ее розвитку. Інєкцію налоксон (антагоніст ОР) (ЗАТ "БІОЛІК", м. Харків) у дозі 0,5 мг / кг у виде 0,04% водного Розчини вводили інтраперітонеально за 20 хвилин до введення даларгіну й в течение ПЕРІОДУ спостереження, одноразово.

Неселективних інгібування АТФ-чутлівіх К + АТФ -каналів віклікалі інєкцією глібенкламіду (ТОВ "Фармацевтична компанія" ЗДОРОВЯ ", м. Харків) у дозі 0,3 мг / кг у виде 0,05% водного Розчини за 20 хвилин до введення даларгіну в течение Усього ПЕРІОДУ спостереження.

У Кожній експеріментальній групі тварин проводили морфологічну детекцію апоптозу кардіоміоцитів с помощью флуоресцентної мікроскопії з Використання барвники Гегст 33342, Який звязується з ДНК; імунофлуоресцентній аналіз (МТТ-аналіз) и кількісне визначення генетичних маркерів апоптозу р53, Bcl-2 в тканіні міокарда; у тій же тканіні методом фотометрії визначавши Відсоток ф-ДНК (Messmer UK, 1996), Активність супероксиддисмутази (СОД) и вміст вільного СФЗ (модіфікованій метод Прохорової М.І., 1982); рівень NO в тканіні міокарда й сіроватці крови за концентрацією NO 2 - й NO 3 - (Орлова Е.А., 2001); годину релаксації протонів води тих же тканин за данімі ЯМР-релаксометра "Mіnіspec pc 100" фірми "Bruker" (Німеччина), укомплектованість модульні програмами: EDM 110A; EDM 510A; 511A; 610A; 612A; 613A, что дозволяють змінюваті послідовність імпульсів; Загальну оксидантним Активність (ЗОА) и Загальну антиоксидантну Активність (заа) Сироватко.

Первинний цифровий матеріал експериментального ДОСЛІДЖЕНЬ БУВ оброблений традіційнімі методами варіаційної статистики (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000). Для ОЦІНКИ достовірності отриманий результатів БУВ Використання крітерій Стьюдента. Результати розціню-валися як достовірні при р <0,05.

Результати дослідження та їх Обговорення. Одним з найбільш характерних біохімічніх крітеріїв ОЦІНКИ актівності процесів апоптозу в тканіні є Показник фрагментації віділеної ДНК (Walker PR, 1994). Проведені нами дослідження показали (Рис. 1), что Найбільший рівень ф-ДНК при моделюванні ДБН (Шляхто Е.В. та ін., 2006; Giordano FJ, 2005) БУВ на третю добу експеримент - 96,28% (р <0 , 01) з подалі зниженя значень до сьомої доби - 14,17% (р <0,01). Попередня активація периферичної м- й д-ОР (Fryer RM, et al, 2000; Лішманов Ю.Б. та ін., 2000) прізвела до достовірного зниженя уровня ф-ДНК по відношенню до групи ДБН на третю, п'яту й сьомий добу - Падіння відсотка фрагментації склалось 20,17% (р <0,05), 19,56% (р <0,001) и 6,97% (р <0,05) відповідно.

ЦІ дані малі своє підтвердження при морфологічній оцінці зрізів сердець відповідніх експериментальний груп Із ЗАСТОСУВАННЯ гематоксілін-еозіну й імунофлуоресцентного забарвлення за ХЕХСТ.

При паралельно введенні глібенкламіду (неселективного блокатора К + АТФ -каналів) и даларгіну спостерігалося повне усування захисну ефект последнего. Механізм цітопротекторної Дії актіваторів мітохондріальніх каналів Повністю НЕ Вівче, однак встановлен, что смороду попереду-жають розпад АТФ. Наші дані дозволяють пріпустіті, что активація м- й д-ОР виробляти до Відкриття До + АТФ -каналів внутрішніх мембран мітохондрій, что может Сприяти енергетіці Клітини.

Мал. 1. Рівень фрагментації ДНК на тлі формирование ДБН й при Попередній актівації периферичної ОР (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

** - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН + Дав (р0,05);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

Завдяк механізмам своєї Дії білок р53 розглядається як проапоптотічній маркер (Das DK, et al, 2004). Вивчення експресії р53 (Рис. 2) показало ее Значне підсілення, починаючі з Першої доби: на 5,3%, 44,6% (р <0,01), 57,2% (р <0,01) и 69, 3% (р <0,01) относительно групи контролю відповідно діб спостереження. ! Застосування даларгіну прізвело до зниженя експресії на третю добу на 3,2%, на п'яту - на 21,9% й на сьомий - на 38,7% відносно групи ДБН.

Мал. 2. Експресія р53 при актівації периферичної ЗР на тлі формирование ДБН (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

Відомо, что кардіоміоціті експресують Білки Bcl-2 родини (Berry С., et al., 2000). Щодо формирование окисного стрес в міокарді експресія внутрішньоклітінного антиапоптотичного маркера Всl-2 (Рис. 3) супроводжували ее зниженя на третю добу на 13,6% (р <0,01), на п'яту - на 29,7% (р <0, 01) и на сьомий - на 18,9% (р <0,01).

Попередня активація периферичної м- й д-ОР прізвела до зниженя експресія на третю добу лишь на 7,5%, на п'яту - на 11,4% (р <0,05) и на сьомий - на 12,3% относительно групи контролю (Рис. 3).

Мал. 3. Експресія Всl-2 при актівації периферичної ЗР на тлі формирование ДБН (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

Трансмембранні Оксидоредуктази широко включені до контролю внутрішньоклітінного окисно-відновного стану (Berridge MV et al., 2000). Вивчення метаболічної актівності клітін міокарда за здатністю мітохондріальніх НАДН-дегідрогеназ перетворюваті водорозчінній МТТ у забарвленій нерозчінній у воде формазану показало (Рис. 4), что при Окісна стресі зниженя їх актівності склалось на Першу добу 20,6% (р <0,01), на третю - 21,5% (р <0,01), на п'яту - 17,2% й на сьомий - 8,3% (р <0,01) відносно контрольних значень.

За умов попередньої актівації периферичної ЗР Активність мітохондріальніх дегідрогеназ булу нижчих за контрольні значення на Першу добу на 14,6%, на третю - на 16,4%, на п'яту - на 10,3% (р <0,05) и на сьомий - на 4,9% (р <0,05).

Мал. 4. Активність мітохондріальніх дегідрогеназ на тлі формирование ДБН й при Попередній актівації периферичної ОР (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

У звязку з тим, что NO розглядається як біфункціональна молекула, Механізм Дії якої Залежить від умов, за якіх вона сінтезується (Манухина Є.Б. і ін., 2002), нами Було Вівче концентрацію его стабільніх метаболітів. Формування ДБН в міокарді супроводжували підвіщенням Загальна уровня NO х вже з Першої доби: на 30,81% (р <0,05), 49,04% (р <0,001), 32,17% (р <0,01) и 14,26% відповідно діб спостереження.

Попереднє! Застосування даларгіну, як активатора периферичної м- й д-ОР, прізвело до зниженя загально вмісту NO х. Показник БУВ підвіщенім лишь на 23,04% (р <0,01), на 30,83% (р <0,01) (зниженя на 12,22% (р <0,05) відносно групи ДБН), на 14 , 59% (р <0,05) (нижчих на 13,31% (р <0,05) относительно групи ДБН) и на 2,34% (зниженя на 10,47% (р <0,05) відносно групи ДБН) відповідно діб спостереження.

Порушення Функції ендотелію при формуванні окисного стрес прізвело до прігнічення механізмів синтезу фізіологічних, нетоксичних доз NO, что можна Було спостерігаті за зниженя відсотком NO 2 - від Загальної кількості NO х: на Першу добу на 23,56%, на третю - на 40,94% (р <0,001), на п'яту - на 55,22% (р <0,001) и на сьомий - на 38,98 % (р <0,001) (Рис. 5).

А

Б

Мал. 5. Співвідношення рівнів стабільніх метаболітів NO 2 - й NO 3 - в тканіні міокарда в Загальній кількості NO х при актівації периферичної ОР (Б) на тлі формирование ДБН (А) (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

При застосуванні даларгіну Показник відсотка нітріт-аніона в Загальній кількості NO х БУВ збільшеній на Першу добу на 4,51% відносно групи контролю й на 36,71% (р <0,001) относительно групи ДБН; на третю й п'яту добу Частка NO 2 - Залишайся зниженя відносно контрольних значень на 28,87% (р <0,05) и 32,62% (р <0,01) відповідно (но збільшеною на 20,43% й 50,47% (р <0,001) відповідно относительно групи ДБН); на сьомий добу спостерігалося зниженя відсотка NO 2 - на 16,96% відносно групи контролю й Підвищення на 36,09% (р <0,001) относительно групи ДБН.

Останнім часом вважається, что при стімуляції апоптозу оксидантами в різніх типах клітін актівується сфінгомієлін-церамідній шлях (Dyntar D., et al., 2001; Son JH, et al., 2007). Нами Було проведене визначення уровня вільного СФЗ в тканіні міокарда (Рис. 6).

Так, у щурів контрольної групи вміст вільного СФЗ дорівнював 2,08 ± 0,31 мкг / г. Експериментальна ДБН супроводжували збільшенням концентрації СФЗ, яка Складанний: 3,05 ± 0,19 мкг / г (p <0,05), 7,02 ± 1,13 мкг / г (p <0,001), 7,05 ± 1, 14 мкг / г (p <0,001) и 9,77 ± 0,94 мкг / г (p <0,001) відповідно до діб спостереження. При актівації периферичної м- й д-ОР Підвищення уровня СФЗ мало Такі значення: 2,87 ± 0,26 мкг / г, 4,13 ± 0,47 мкг / г (p <0,01), 3,77 ± 0 , 48 мкг / г (p <0,05) и 4,34 ± 0,41 мкг / г (p <0,001) відповідно до діб спостереження.

Проведення дослідження кореляційного звязку между вмістом вільного СФЗ й рівнем ф-ДНК лишь підтверджує один з механізмів розвитку ДБН при Цій моделі (Suzuki E., Et al., 2004; Matsunaga T., еt al., 2004).

Мал. 6. Співвідношення відсотка вільного СФЗ до відсотка ф-ДНК при актівації периферичної ЗР на тлі формирование ДБН (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

Більш низька Відсоток Збільшення СФЗ может констатуваті Менш вираженість рівень медіації для подальшої деструкції фосфоліпідніх компонентів клітінніх мембран та апоптотічної загібелі кардіоміоцитів (Рис. 6).

Характеризуючи ПРООКСИДАНТНО й антіокісну рівновагу в тканинах ми оцінілі Активність СОД, як ключовими ферменту антиоксидантної захисту (Molavi B. et al., 2004; Childs C. et al., 2002). Встановлен, что формирование окисного стрес супроводжували значний підвіщенням актівності цього ферменту з максимальним значенням на Першу добу спостереження й подалі поступовім зниженя до сьомої доби (Табл. 1).

Попереднє! Застосування агоністу ЗР такоже віклікало Значне Підвищення актівності цього ферменту, а відмінністю Було, что до останньої доби експеримент значення Залишайся доволі скроню, и це, можливо, забезпечен захист клітін міокарда від проапоптотічної Дії активних форм кисня.

З метою підтвердження системного характеру зазначеним вплівів ми провели біохімічне дослідження ЗОА й заа Сироватко крови. ЦІ показатели Досить виразности говорили про наявність найбільшіх пошкоджень у системе антиоксидантної захисту, в основном на третю й п'яту добу, коли смороду малі статистично достовірну відмінність относительно контрольних величин. Такоже дуже чітко простежувалася динаміка змін у БІК актівації антиоксидантної захисту при актівації периферичної ОР, что мало вираженість кореляційній звязок з рівнем ф-ДНК.

Таблиця 1.

Показники актівності СОД, ЗОА й заа Сироватко крови при актівації периферичної ЗР на тлі формирование ДБН (%)

СОД,% інгіб.

ЗОА (%)

Заа (%)

ДБН

ДБН + Дав

ДБН

ДБН + Дав

ДБН

ДБН + Дав

Контроль, (n = 6)

17,51 ± 0,8

17,51 ± 0,8

55,32 ± 0,9

55,32 ± 0,9

55,17 ± 0,7

55,17 ± 0,7

1 доба, (n = 6)

81,71 ± 1,8 *

83,46 ± 1,4 *

58,86 ± 1,6

56,11 ± 1,3

25,75 ± 0,6 **

53,63 ± 0,9 #

3 доба, (n = 6)

48,25 ± 1,1 *

36,38 ± 1,2

68,57 ± 1,2 *

59,32 ± 1,4 #

20,89 ± 1,1 **

32,51 ± 1,8 *, #

5 доба, (n = 6)

47,86 ± 1,0 *

45,33 ± 1,3 *

63,98 ± 1,2 *

57,64 ± 1,2 #

37,09 ± 1,4 **

44,76 ± 1,3 *

7 доба, (n = 6)

28,79 ± 1,1 *

44,36 ± 1,6 *, #

57,72 ± 1,8

55,59 ± 1,1

47,78 ± 1,5 *

51,83 ± 1,1

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

Існує припущені, что в процесі апоптозу спостерігається Порушення обєм-регулююча механізмів Клітини (Yu S., et al., 2000; Segal MS, et al, 2001), у тому чіслі й роботи Cl - - і К + -обєм-регулююча каналів . Нами були досліджені ЯМР-релаксаційні показатели клітінного обєму залежних від ПЕРІОДУ спостереження (Табл. 2).

Динаміка показніків спін-спінової й спін-гратчастої релаксації до третьої доби формирование окисного стрес свідчіть про Втрата тканини міокарда Фракції Вільної води, что, за експериментального данімі, супроводжували дегідратацією тканин серця на Першу добу й подалі тенденцією до гідратації, починаючі з третьої доби (Рис . 7, 8).

Таблиця 2.

Розподіл показніків Т1 и Т2 в тканіні міокарда при актівації периферичної ЗР на тлі формирование ДБН (мс)

Т1 (мс)

Т2 (мс)

ДБН

ДБН + Дав

ДБН

ДБН + Дав

Контроль (n = 6)

554,88 ± 22,46

554,88 ± 22,46

44,95 ± 0,41

44,95 ± 0,41

1 доба, (n = 6)

484,25 ± 27,86 *

680,79 ± 17,38 **, #

42,13 ± 0,47 **

46,87 ± 0,68 *, #

3 доба, (n = 6)

544,81 ± 35,86

658,56 ± 8,75 **, #

42,62 ± 2,35

45,92 ± 0,81

5 доба, (n = 6)

545,81 ± 44,79

693,72 ± 10,12 **, #

47,64 ± 0,62 **

49,17 ± 0,88 **, #

7 доба, (n = 6)

667,85 ± 17,91 **

692,19 ± 20,15 **

46,24 ± 1,39

38,88 ± 1,58 **, #

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

Отрімані дані лишь підтверджують етапність Вивчення Ранее механізму розвитку ДБН при застосуванні антрацікліновіх антібіотіків (втрата клітіною Рідини й подалі "зморщення"), Який Заснований на інгібуванні синтезу нуклеїнових кислот, модіфікації в транспорті сарколемального Са 2+, розвитку дисбалансу в електролітному складі (Minotti G. , et al., 2004). Інтервал втратою структурованої внутрішньоклітінної води співпадав з початком максимальних проявів клітінної деградації, тому нами Було Виявлено, что Показник Фракції внутрішньоклітінної води (Ра) МАВ Досить чіткій кореляційній звязок з відсотком фрагментації ДНК в тканіні міокарда.

Мал. 7. Розподіл показніків внутрішньо- (Ра) й позаклітінної (Рb) води в тканіні міокарда при формуванні ДБН (%).

Примітки: ** - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,01).

На рис. 7 и 8 видно, что на тлі! Застосування даларгіну Т1-Релаксація булу достовірно вища за групу формирование патології, а Т2 - мала тенденцію до зниженя. Таке сполучення годин складових указує, что сигнал іде від крісталічної Фракції води, тобто спостерігається ее Приріст. При цьом Частка внутрішньоклітінної води на дере, третю й сьомий добу мала тенденцію Наближення до контрольних значень.

Мал. 8. Розподіл показніків внутрішньо- (Pa) й позаклітінної (Pb) води в тканіні міокарда при актівації периферичної ЗР на тлі формирование ДБН (%).

Примітки: * - показатели достовірні по відношенню до групи контролю (р0,05);

# - показатели достовірні по відношенню до групи ДБН (р0,05).

У наших дослідженнях формирование стану окисного стрес в міокарді супроводжували підвіщенням експресії про- (р53) и зниженя експресії антиапоптотичного (Bcl-2) білків, что проявилося підвіщенням уровня ф-ДНК кардіоміоцитів. Такоже спостерігався дисбаланс между захисних силами організму й пошкоджуючих факторами в БІК останніх.

Дані, отрімані в результате Вивчення розподілу й функцій ОР та опіоїдніх пептидів, дозволяють пропонуваті! Застосування ціх препаратів з успішнім результатом при ряді патологічніх станів серцево-судінної системи. Встановлен, что ЦІ ендогенні Речовини могут буті більш сільнодіючімі, но віклікаті менше Кількість побічніх ефектів, чем звічайні фармакологічні засоби [Gross GJ, Peart JN, 2007].

Встановлені Механізми пострецепторної Дії ліганду ЗР дозволяють Говорити про долю у пошкодженні міокарда при гіперсекреції активних форм кисня таких посередників як NO й СФЗ. Становится зрозумілім, что гіперпродукція NO на даній моделі ДБН актівувала процеси клітінної загібелі.

ВИСНОВКИ

Активація периферичної м- й д-опіатніх рецепторів при антрацікліновій моделі стімуляції апоптозу міокарда супроводжується зниженя его проявів у кардіоміоцітах, актівацією антиоксидантної системи й нормалізацією клітінного обєму за участю системи оксиду азоту, сфінгомієлінового шляху, К + АТФ -каналів.

Вівче біохімічні ознака актівації апоптотичних процесів у серці на моделі формирование гострої серцевої недостатності окисного ґенезу. Відмічено максимально Підвищення деградації ДНК (на 96,28%) на третю добу спостереження. Встановлен, что за умов актівації опіатніх рецепторів морфологічні й біохімічні прояви апоптозу малі значний менше вираженість у тканіні міокарда (Підвищення на 56,79%).

Визначили, что початкова стадія гострої серцевої недостатності окисного генезу супроводжували максимальним підвіщенням Загальна уровня оксиду азоту в тканіні міокарда на третю добу (на 49,04%). Перерозподіл стабільніх метаболітів оксиду азоту в БІК нітріт-аніонів при актівації периферичної м- й д-опіатніх рецепторів свідчіть про можливий доля останніх у регуляції системи оксиду азоту.

Антиапоптотичного ефект синтетичного лей-енкефаліну - даларгіну - реалізується через актівацію м- й д-опіатніх рецепторів за участю К + АТФ -каналів кардіоміоцитів за умов стімульованого апоптозу.

На тлі окисного стрес в міокарді як перша Реакція спостерігається Підвищення актівності системи антиоксидантного захисту (у 4,6 рази) з подалі ее прігніченням. За умов актівації периферичної опіатніх рецепторів НЕ спостерігалося зниженя актівності супероксиддисмутази в течение Усього експеримент.

Встановлен активація сфінгомієлінового метаболічного шляху в міокарді при експеріментальній гострій серцеві недостатності.Вона супроводжували прогресуючім підвіщенням вільніх сфінгоїдніх основ (у 4,7 рази). Під вплива даларгіну цею Показник значний зніжувався (у 2,1 рази).

З Першої по третю добу розвитку гострої серцевої недостатності в міокарді Встановлені зниженя годині релаксації й Частки внутрішньоклітінної води кардіоміоцитів, Які з третьої по сьомий добу змінювалісь у БІК гідратації клітін. При стімуляції апоптозу на цьом тлі через опіатні рецептори спостерігалося Збільшення часу релаксації й Зменшення внутрішньоклітінного обєму, что обумовлено ущільненням гідратного шару тканінної води й вказує на нормалізацію клітінніх процесів у міокарді.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНІХ РОБІТ

Андросова М.Є. Вплив даларгіну на ЯМР-релаксацію сироватки крові щурів при експериментальній серцевій недостатності // Український медичний альманах. - 2006. - Т. 9, № 2. - С. 11-12.

Комаревцева І.А., Андросова М.Є. Зміст фрагментованою ДНК в міокарді щурів при доксорубіцин-індукованої серцевої недостатності і на тлі введення даларгіну // Український медичний альманах. - 2006. - Т. 9, № 3. - С. 71-73.

Комаревцева І.А., Андросова М.Є. Рівень вільного сфингозина в міокарді при введенні даларгіну на тлі доксорубіцин-індукованої кардіоміопатії // Український медичний альманах. - 2006. - Т. 9, № 4. - С. 49-50.

Комаревцева І.А., Андросова М.Є. ЯМР-релаксація клітин міокарда щурів при стимуляції опіоїдних рецепторів на моделі серцевої недостатності // Український медичний альманах. - 2006. - Т. 9, № 5. - С. 61-63.

Андросова М.Є. Стабільні метаболіти оксиду азоту при експериментальної серцевої недостатності на тлі активації опіатнихрецепторів // Український журнал КЛІНІЧНОЇ та лабораторної медицини - 2007. - Т. 2, № 1. - С. 61-65.

Комаревцева І.О., Андросова М.Є. Вплив актівації периферичної опіатніх рецепторів на вміст стабільніх метаболітів оксиду азоту, вільного сфінгозіну, оксидантно-антиоксидантний стан при експериментальний Окісна стресі міокарда // Медична хімія. - 2007. - Т. 9, № 2. - С. 29-33.

Патент України на корисностей модель. Способ Підвищення толерантності кардіоміоцитів до доксорубіцін-індукованого оксидативного стрес / Комаревцева І.О., Андросова М.Є. - № 29411 від 10.01.2008, Бюл. № 1.

Патент України на корисностей модель. Метод ранньої діагностики апоптотичних процесів у культурах клітін / Комаревцева І.О., Клімочкіна О.М., Орлова О.А., Андросова М.Є., Шіпілова І.В., Бриндак Д.В. - № 25410 від 10.08.2007, Бюл. № 12.

Патент України на корисностей модель. Способ визначення вмісту стабільніх метаболітів оксиду азоту в культурі клітін / Комаревцева І.О., Клімочкіна О.М., Андросова М.Є., Шіпілова І.В. - № 24577 від 10.07.2007, Бюл. №10.

Андросова М.Є., Денисенко А.С., Приходько А.С., Парінов Р.А. Апоптотичних Загибель кардіоміоцитів щурів під дією доксорубіціну // Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні: Тези I регіональної науково-практичної конференции молодих вчених и студентов. - Луганськ, 2005. - С. 41-42.

Androsova M.Ye., Parinov RA, Shipilov KVNMR-relaxometry of serum of animals at doxorubicin induced heart insufficiency // Теоретичні та практичні аспекти сучасної медицини: Матеріали 78-ї науково-практичної конференції студентів та молодих учених. - Сімферополь, 2006. - С. 115.

Андросова М.Є., Парінов Р.А., Соловйова І.В. Біохімічні механізми активації опіоїдних рецепторів при серцевій недостатності у щурів // Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні: Тези II регіональної науково-практичної конференции молодих вчених и студентов. - Луганськ, 2006. - С. 10-11.

Андросова М.Є., Парінов Р.А. Вплив даларгіну на сфінгозіновий сигнальний шлях активації апоптозу при експериментальній серцевій недостатності // Актуальні проблеми сучасної медицини: Тези 60 науково-практичної конференции студентов и молодих вчених національного медичного університету імені О.О.Богомольця з міжнародною участю. - Київ, 2006. - С. 49-50.

Комаревцева І.А., Орлова Е.А., Андросова М.Є., Сенча В.Н. Активація опіатнихрецепторів і рівень метаболітів NO при доксорубіцин-індукованої серцевої недостатності // IX Укр. біохімічній з "їзд: Матеріали зїзду - Харків, 2006. - Т. 2. - С. 69.

Анотація

Андросова М.Є. Роль опіоїдів у регуляції механізмів апоптозу при гострій серцевій недостатності в експеріменті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступенів кандидата медичний наук за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Луганський державний медичний університет, Луганськ, 2008.

Дисертація присвячено вивченню роли біохімічніх регуляторних систем - опіатніх рецепторів, сфінгомієлінового шляху, оксиду азоту й К + АТФ -каналів - у регуляції апоптозу в процесі формирование гострої серцевої недостатності.

Встановлен, что стімуляція програми клітінної загібелі при експеріментальній гострій серцевій недостатності супроводжується зниженя антиоксидантних властівостей організму, актівацією сфінгомієлінового метаболічного шляху, підвіщенням вмісту стабільніх метаболітів оксиду азоту (здебільшого за рахунок нітрат-аніону), гідратацією клітін. Досліджено рівень апоптозу в міокарді при актівації периферичної опіатніх рецепторів за участю К + АТФ - каналів.

У работе Вперше представлена ​​можлівість регуляції апоптотичних процесів у міокарді через періферічні м- й д-опіатні рецептори. Встановлен, что в цьом процесі такоже прийомів доля система оксиду азоту (за рахунок конститутивних синтаз), сфінгомієліновій сигнальний шлях, что супроводжували більш трівалою стімуляцією антиоксидантної системи організму, приростом у міокарді Фракції крісталічної води зі зниженя Частки внутрішньоклітінної води. Це підтверджує можливий доля опіоїдів у позитивному впліві на Підтримання нормальної життєдіяльності кардіоміоцитів.

Ключові слова: міокард, серцево недостатність, апоптоз, фрагментація ДНК, оксид азоту, сфінгозін, опіатні рецептори, ЯМР-Релаксація.

АННОТАЦІЯ

Андросова М.Є. Роль опіоїдів у регуляції механізмів апоптозу при гострій серцевій недостатності в експерименті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Луганський державний медичний університет, Луганськ, 2008.

Дисертація присвячена вивченню ролі біохімічних регуляторних систем - опіатнихрецепторів, сфінгоміелінового шляху, оксиду азоту і К + АТФ -каналів - в регуляції апоптозу в процесі формування гострої серцевої недостатності.

В основі роботи лежить: дослідження ступеня розвитку апоптотичних процесів в міокарді біохімічно (по фрагментації ДНК) в зіставленні з морфологічної детекцией і імунофлуоресцентний визначенням експрес проапоптотических (p53) і антиапоптотических (Bcl-2) маркерів (з використанням ядерного барвника Хехст) при стимулюванні програмованої клітинної загибелі (антрациклінової модель експериментальної гострої серцевої недостатності); встановлення рівня загального оксиду азоту за змістом його стабільних метаболітів - нітрит і нітрат-аніонів в тканини міокарда; розгляд системи сфингозина, як сігналпередающей в розвитку апоптозу; визначення активності мітохондріальних дегідрогеназ і основного ферменту антиоксидантного захисту - супероксиддисмутази; зміни часу релаксації протонів тканинної води за даними ЯМР-релаксометріі.

Як показало наше дослідження, ДНК-фрагментація мала чітку пряму кореляцію з експресією проапоптотических (p53) і зворотну кореляцію з експресією антиапоптотических (Bcl-2) маркерів. Активація периферичних м- і д-опіатних рецепторів Даларгін на тлі формування гострої серцевої недостатності приводила до зменшення рівня фрагментованою ДНК, що супроводжувалося наближенням показників активності мітохондріальних дегідрогеназ до контрольних значень. Це, в свою чергу, супроводжувалося пригніченням окислювальних процесів в міокарді і активацією антиоксидантної системи організму.

При формуванні гострої серцевої недостатності було виявлено підвищення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту (переважно за рахунок нітрат-аніону). Попередня активація периферичних опіатних рецепторів приводила до зниження загального рівня оксиду азоту зі збільшенням частки нітрит-аніону.

Була встановлена ​​активація сфінгоміелінового сигнального шляху при стимуляції окислювальних процесів в міокарді, що проявилося прогресуючим достовірним підвищенням рівня вільного сфингозина. Кореляційний аналіз показав залежність між рівнем вільних сфінгоїдних підстав і ступенем деградації ДНК (позитивна), активністю супероксиддисмутази (негативна) і змістом стабільних метаболітів оксиду азоту (позитивна).

В умовах стимуляції апоптозу встановлено зниження часу релаксації з явищами дегідратації тканин з перших по третю добу спостереження, де інтервал втрати структурованої внутрішньоклітинної води збігався з початком максимальних проявів клітинної деградації (сильна позитивна кореляційний зв'язок). З третьої по сьому добу спостерігалося збільшення клітинного об'єму. При регуляції апоптозу в цих умовах через опіатні рецептори спостерігався приріст фракції кристалічної води. При цьому частка внутрішньоклітинної води мала тенденцію наближення до контрольних значень.

Встановлено підвищення рівня фрагментованою ДНК при блокаді К + АТФ -каналів плазматичної і мітохондріальної мембран клітин міокарда під дією глібенкламіду на тлі активації опіатних рецепторів. Ці дані свідчать про участь К + АТФ -каналів в регуляції апоптотичних процесів в міокарді.

Таким чином, встановлені ефекти активації опіатнихрецепторів дозволяють говорити про участь в пошкодженні міокарда при гіперсекреції активних форм кисню таких посередників як оксид азоту і сфингозин.

Це, в свою чергу, дає нові наукові уявлення про біохімічні процеси при патологіях і сприяє продовженню досліджень по розробці інших терапевтичних підходів в клінічній кардіології.

Ключові слова: міокард, серцева недостатність, апоптоз, фрагментація ДНК, оксид азоту, сфингозин, опіатні рецептори, ЯМР-релаксація.

SUMMARY

Androsova М.Ye. The role of opioids оn apoptosis mechanisms regulation at acute heart failure in experiment. - Manuscript.

The dissertation on competition a scientific degree of the candidate of medical sciences at a speciality 14.01.32 - medical biochemistry. - Luhansk state medical university, Luhansk, 2008.

The dissertation is dedicated to studying of a biochemical regulation of apoptosis on heart insufficiency formation in signal pathways of cell processes regulation - opioid receptors, sphingomyelinal, nitrogen monoxide and in cell volume regulation.

It was established what cell death program stimulation on experimental acute heart failure is accompanied with decreasing of antioxidant properties of organism, sphingomyelin pathway activation, also increasing on nitrogen monoxide stable metabolites level (mainly about nitrate-anion), with overhydration of cardiomyocytes. The apoptosis level in myocardium through peripheral opioid receptors activation with К + АТФ -channels participation was discovered.

In research work it is for the first time is presented possibility of apoptotic process regulation in myocardium through peripheral м- and д-opioid receptors. It was established what system of nitrogen monoxide, sphingomyeline signal pathway also took part at this process, and this accompanied with more long stimulation of antioxidant system, increasing in myocardium the crystal water fraction with decreasing of intracellular water part. This confirmed possible participation of opioids in positive influence on normal cardiomyocites vital function maintenance.

Key words: myocardium, heart failure, apoptosis, DNA-fragmentation, nitrogen monoxide, sphingosine, opioid receptors, NMR-relaxation.


:)

  • ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
  • Основні ЗМІСТ РОБОТИ
  • СПИСОК ОПУБЛІКОВАНІХ РОБІТ

  • Скачати 48.06 Kb.