імунологічні методи






    Головна сторінка





Скачати 17.85 Kb.
Дата конвертації30.11.2017
Розмір17.85 Kb.
Типреферат

РЕФЕРАТ

імунологічні методи

2009


ВСТУП

В імунології застосовується цілий ряд експериментальних методів з інших областей біології. Так, виділення антигенів і антитіл проводять за допомогою біохімічних методів фракціонування білків, гени імунологічно важливих молекул секвеніруют звичайними молекулярно-генетичними методами. Разом з тим в імунології розроблені і свої спеціальні методи дослідження, засновані на взаємодії антиген-антитіло. Ці імунологічні методи в свою чергу знайшли застосування в різних областях біології. Зокрема, будь-які молекули, що володіють антигенними властивостями, можна виявляти в тканинах імуногістохімічними методами. Для кількісного визначення таких молекул, присутніх в надзвичайно низьких концентраціях, застосовують радіоіммуноаналіз і ферментний іммуносорбентний аналіз. В даний час існують сотні різноманітних імунологічних методів: найбільш широко застосовуються з них описані в цій роботі.


ВЗАЄМОДІЯ антиген-антитіло

Реакція преципітації. Одним з перших описаних проявів взаємодії антиген-антитіло було утворення преципітату при змішуванні обох реагентів в еквівалентних або близьких до еквівалентним кількостях. Воно спостерігається при постановці класичної реакції преципітації з розчинними антигенами і антитілами. Якщо проводити цю реакцію в агарових гелі, можна диференціювати окремі реакції антиген-антитіло, зумовлені різними популяціями антитіл, присутніми в сироватці. Такий метод, названий методом подвійного иммунодиффузии, застосовується також для перевірки схожості між різними антигенами.

Однак деякі суміші антигенів занадто складні для поділу просто шляхом дифузії і преципітації, і для аналізу таких сумішей був розроблений метод іммуноелектрофореза - перш ніж виявляти антигени візуально в реакції преципітації, їх розділяють по заряду за допомогою цього методу.

Методи, засновані на дифузії в гелі, дозволяють визначати антигени і антитіла лише якісно, ​​кількісну ж оцінку реагуючих компонентів проводять розробленим пізніше методом простої радіальної імунодифузії.

Іммунодіффузія в електричному полі можна проводити з одночасним зустрічним рухом антигенів і антитіл; цей спосіб названий зустрічним електрофорезом. Аналогічна модифікація простої радіальної імунодифузії отримала назву ракетний електрофорез.

Описані методи використовуються для визначення антигенів і антитіл в концентрації від 20 м кг / мл до 2 мг / мл.

Реакції гемаглютинації і зв'язування комплементу

Якщо антитіла присутні в таких низьких концентраціях, що їх не вдається виявити і кількісно визначити за допомогою зустрічного і ракетного електрофорезу, застосовують реакцію гемаглютинації. Вона заснована на здатності антитіл перехресно зв'язуватися з еритроцитами, взаємодіючи з їх поверхневими антигенами.

Реакція антиген-антитіло веде до утворення імунних комплексів, які пов'язують комплемент при його активації класичним шляхом, і на цьому заснований один з кількісних методів визначення антигенів і антитіл. За допомогою реакцій гемаглютинації і зв'язування комплементу вдається виявляти антитіла, присутні в концентрації <1 мкг / мл.

Пряма і непряма імунофлуоресценція

Імунофлуоресцентний методи широко використовуються для виявлення аутоантитіл і антитіл до тканинних і клітинних антигенів. Хоча ці методи технічно більш складні, ніж описані вище, вони мають явну перевагу в тих випадках, коли потрібно визначити число видів антитіл. Використовуючи зрізи тканин, на одному предметному склі можна виявити антитіла до кількох різних антигенів, встановивши при цьому їх внутритканевое або внутрішньоклітинний розподіл.

Крім того, за допомогою імунофлуоресцентний тестів можна ідентифікувати окремі клітини в клітинній суспензії, т. Е. Виявляти антигени на поверхні живих клітин. Для цієї мети суспензію живих клітин, флуоресцентно забарвлених специфічними реагентами, пропускають через проточний флуоресцентний клітинний сортер - прилад, що вимірює інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектру і потім розділяє клітини за параметрами світіння. Даний метод дозволяє виділяти різні клітинні популяції, т. Е. Розділяти клітини, що несуть специфічні поверхневі антигени і відповідно до цього пофарбовані різними флуоресцентно міченими антитілами.

Імунологічний аналіз антигенів і антитіл за допомогою мічених реагентів

Методи цієї категорії відрізняються дуже високою чутливістю і економічністю в витрачення реагентів. Найбільш поширений з усіх імунологічних методів - це, ймовірно, іммуносорбентний аналіз антитіл із застосуванням лігандів, мічених радіоізотопами або ферментами; він дозволяє досліджувати велику кількість зразків у відносно короткий час. Кількість антигену можна вимірювати за допомогою методу «подвійний антигенної пастки» або конкурентного іммуноаналі через із застосуванням будь-якого маркера для визначення.

Імуноблотинг і іммунопреціпітація

Описані вище методи зазвичай застосовують для визначення рівня конкретних відомих антигенів і антитіл, однак часто необхідно ідентифікувати і охарактеризувати невідомі заздалегідь антигени, що містяться в багатокомпонентної суміші. Для цієї мети особливо підходить імуноблотинг.

При проведенні иммуноблоттинга складну суміш антигенів спочатку піддають гель-електрофорез, а потім фракціоновані пептиди переносять на лист нітроцелюлози для ідентифікації індивідуальних антигенів за допомогою специфічних антисироваток. Виробляючи попереднє поділ в гелі з додецилсульфатом натрію або в гелі для изо-електричного фокусування можна отримати дані про розміри і ізоелектричної точці досліджуваних антигенів, а також про подібність між ними.

У деяких випадках в результаті електрофорезу в гелі і процедури блоттинга антиген денатурує так, що деякі з його епітопів руйнуються і втрачають здатність зв'язуватися зі специфічними антитілами. У такій ситуації замість блоттинга слід використовувати іммунопреціпітація, щоб встановити, який антиген пов'язують антитіла. Даний метод може бути застосований для визначення як розчинних, так і мембранних антигенів.


ОТРИМАННЯ ЧИСТИХ АНТИТІЛ

В імунологічних дослідженнях часто виникає необхідність в отриманні очищених препаратів антитіл, т. Е. Антігенспеціфічних або неспецифічних імуноглобулінів. Виділення неспецифічних імуноглобулінів з сироватки зазвичай проводять шляхом послідовного фракціонування білків, яке включає наступні етапи.

• Осадження гаммаглобулінів в 30-50% розчині сульфату амонію.

• Гель-фільтрація для отримання молекул відповідних розмірів.

• Ионообменная хроматографія з метою виділення молекул, що несуть сумарний позитивний заряд при нейтральному рН.

• Аффинная хроматографія з використанням природних лігандів імуноглобулінів, наприклад стафілококового білка А.

Виділення антігенспеціфічних імуноглобулінів здійснюють методом афінної хроматографії. Антиген «пришивають» до частинок сефарози і зв'язалися з ним «чисті» антитіла елюіруют з імуносорбенту хаотропнимі агентами або буферним розчином. Метод афінної хроматографії застосовують і для отримання очищених препаратів антигенів.

Отримання моноклональних антитіл

Іншим способом отримання індивідуальних антитіл певної специфічності служить гібридомна технологія - створення ІММОРТАЛ-зовано лінії клітин, що продукують антитіла тільки однієї специфічності, т. Е. Моноклональні. У такій культурі можна підтримувати антителообразование невизначено довгий час. Моноклональні антитіла незрівнянно краще відповідають цілям імуноаналізу, ніж гетерогенні сироватки, одержувані від імунних тварин, і тому знайшли широке застосування в різних областях біології в якості високоспецифічних зондів.

Ефективно продукувати моноклональні антитіла можуть будь-які В-клітини, необхідно лише зробити їх для цього безсмертними і проліферуючими. Найчастіше для цієї мети отримують гібридні клітини - шляхом злиття мишачих спленоцитів з мієломний В-клітинами від мишей тієї ж лінії, що не секретуючими власних антитіл. Можливо також отримати міжлінійні або міжвидові гібриди, проте вони часто нестабільні. Інший метод імморталізаціі - це трансформація клітин, наприклад в разі По-клітин людини шляхом інфікування вірусом Епштейна-Барр.

Розроблено також новий метод отримання антитіл, заснований на використанні бактеріофагів. За допомогою цього цікавого методу вдається отримати експресію на поверхні нитевидного бактеріофага М13 варіабельних областей у вигляді фрагментів антитіл, що зв'язують антиген з певною специфічністю і авідності. Маючи в своєму розпорядженні бібліотекою таких експрессіруемих бактериофагом фрагментів, можна проводити відбір фагових частинок, які продукують той чи інший Fv-фрагмент. Крім того, якщо даними бактериофагом інфікувати відповідні бактерії, вони починають виділяти Fv-білок у великій кількості в культуральне середовище. Такий підхід не вимагає обов'язкової імунізації тварин або людини.

Моноклональні антитіла являють собою чітко визначений реагент, але вони не мають більш високу специфічність у порівнянні з поликлональной антисироваткою, що розпізнає антиген в результаті взаємодії імуноглобулінів з його різними епітопами.

ВИЗНАЧЕННЯ комплементу

Найбільш простий спосіб вимірювання активності комплементу полягає у визначенні концентрації сироватки, що викликає гемоліз 50% клітин в стандартному препараті еритроцитів, сенсибілізованих антигеном. Реакцію проводять в пробірках або на мікропланшетах. Для приблизної оцінки активності комплементу більш зручний простий радіальний гемоліз. Цей метод схожий з простої радіальної їм-мунодіффузіей, за винятком того що в лунки вносять досліджувану сироватку, а гель містить ЕСА. Навколо лунки, що містить активний комплемент, утворюється зона гемолізу, величина якої пропорційна кількості комплементу в досліджуваній сироватці. Даний метод дозволяє визначати загальну активність компонентів класичного і литического шляхів активації, однак якщо в сироватці виявлений дефіцит комплементу, цим методом неможливо встановити, відсутністю будь компонента дефіцит обумовлений.

Існують також методи для визначення різних окремих компонентів комплементу по їх змісту або функціональної активності. Це важлива відмінність, так як компонент може бути присутнім в нормальній кількості, але бути функціонально неактивним. Зміст індивідуальних білків комплементу зазвичай визначають за допомогою радіоіммуноаналіза або ферментного іммуносорбентний аналізу, використовуючи антитіла, специфічні до даного білку. Для вимірювання функціональної активності в суспензію сенсибілізованих еритроцитів вносять всі компоненти комплементу, необхідні для лізису, за винятком досліджуваного білка.

ВИДІЛЕННЯ ПОПУЛЯЦІЙ ЛІМФОЦИТІВ

Для проведення багатьох імунологічних досліджень in vivo та in vitro потрібні ті чи інші популяції лімфоцитів. Їх отримують від експериментальних тварин, в основному з тимуса, селезінки і периферичних лімфовузлів. Деякі спеціальні дослідження вимагають виділення клітин з інших ділянок організму, наприклад з пеєрових бляшок. Рециркулируют клітини можна отримати шляхом канюлирования грудного лімфатичного протоку і збору клітин протягом декількох годин. У людини найбільш легко виділити лімфоцити периферичної крові, а хірургічним шляхом можна отримати також клітини селезінки, мигдаликів і лімфовузлів. Однак хірургічно відібраний матеріал часто містить інфекційні агенти або пухлинні клітини, в залежності від захворювання, яке викликало необхідність хірургічного втручання. Слід мати на увазі, що клітинні популяції, що містяться в перерахованих тканинах, абсолютно різні як за ступенем зрілості лімфоцитів, так і за чисельним співвідношенням в них клітин різних типів.

Тимус є джерелом досить чистою Т-клітинної популяції, проте складові її лімфоцити розрізняються за ступенем зрілості.При роботі з лімфоцитами з інших органів і тканин часто виникає необхідність у виділенні окремих субпопуляцій для аналізу їх особливих функцій. Застосування з цією метою описаного вище проточного флуоресцентного клітинного сортера, що дозволяє розділяти лімфоцити по їх поверхневим маркерами, дозволяє отримувати лише обмежене число клітин, оскільки швидкість цитометрії з сортуванням дуже низька. Існує, однак, і ряд методів, що дозволяють виділяти лімфоцити і їх окремі субпопуляції відразу з усього обсягу досліджуваного зразка, - центрифугування в градієнті щільності, розеткоутворення, пеннінг і магнітне розділення.

Виділення в градієнті щільності засноване на тому, що лімфоцити мають меншу щільність, ніж еритроцити і гранулоцити. Цей спосіб дозволяє виділяти більшу частину лімфоцитів крові. Розеткоутворення і пеннінг використовують для виділення субпопуляцій. Пеннінг є різновидом афінної хроматографії стосовно лімфоцитів. На подібному принципі заснований і спосіб поділу за допомогою магнітних гранул, покритих специфічними антитілами. При змішуванні з клітинами гранули пов'язують ті з них, які розпізнаються фіксованими антитілами. Ці клітини можна потім змити з гранул або виділити шляхом накладення магнітного поля.

Інший спосіб - він застосовується для видалення непотрібної клітинної популяції, - заснований на використанні антитіл і комплементу. Якщо до суміші клітин додати специфічні антитіла, а потім комплемент, клітини відповідної субпопуляції будуть лизировать. Звичайно, для цього методу придатні лише такі антитіла, які зв'язують комплемент; крім того, клітини-мішені повинні нести на поверхні достатню кількість молекул антигену, щоб фіксувати литическую дозу комплементу.

Джерелом певних популяцій лімфоцитів можуть служити антігенспеціфічние Т-клітинні лінії, культивовані протягом тривалого періоду. Отримання таких ліній дозволяє обійтися без частого виділення первинних культур з органів і тканин тварин.

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ ефекторних клітин

Розроблено різні методи для визначення ефекторних функцій лімфоцитів, зокрема продукції антитіл, цитотоксичності та опосередкованої Т-клітинами допомоги і супрессии.

В-клітини, що продукують IgM- або IgG-антитіла, можна визначити за допомогою методу локального гемолізу, або реакції бляшкоутворення. Іншим способом виявлення антітелообразующіх клітин служить імуноферментний тест ELISPOT. Він дозволяє визначати функціонально активні Т-клітини, секретіруюшіе ті чи інші розчинні медіатори, т. Е. Цитокіни. Визначення проводять на підкладці з іммобілізованими антитілами до специфічного цитокіну. Ці антитіла пов'язують даний цитокін, що виділяється Т-кліткою в навколишнє зону, і ефект зв'язування можна виявити шляхом відповідної обробки підкладки: навколо цітокінвиделяющіх Т-клітин буде видно забарвлені цятки.

Для визначення антігенспеціфічних Т-клітин часто використовують тест стимуляції лімфоцитів - проліферативний відповідь Т-клітин на антиген, що виявляються за включенню ними 3Н-тимідину. Цитотоксичну активність клітинних популяцій зазвичай визначають за їхньою здатністю лизировать клітини-мішені. Кількісно лізис клітин-мішеней визначають за допомогою тесту з вивільненням міченого хрому.

міграція лімфоцитів

В експериментах по вивченню міграції лімфоцитів in vivo зазвичай досліджують розподіл в тих чи інших тканинах введених внутрішньовенно мелекул адгезії, мітять лімфоцити або ендотеліальні клітини і використовують блокують адгезію антитіла для иммунопреципитации специфічних молекул адгезії.

Трансгенні тварини І СПРЯМОВАНА ДОСТАВКА ГЕНОВ

трансгенні тварини

Один із шляхів для вивчення функцій тієї чи іншої молекули - це створення трансгенних тварин, у яких ген даної молекули або делетірован, або експресується, але на надвисокий рівень або з утворенням зміненого продукту. Оригінальний спосіб отримання трансгенних тварин складається в ін'єкції приблизно ста копій даного гена безпосередньо в пронуклеус заплідненої яйцеклітини. Яйцеклітину переносять потім у яйцевод ложнобеременной миші-самки, в матці якої і розвивається ембріон. Потомство таких мишей відрізняється варіабельністю. У невеликого числа ембріонів одна або більше копій гена вбудовується в одну з хромосом до першого клітинного ділення. Ці тварини є гетерозиготами по трансгенних. У іншій частині тварин включення трансгена відбувається після першого поділу, і миші виявляються химерами, у яких поряд з нормальними клітинами є клітини, що містять трансгени. У більшості мишей трансгени не вбудовується в хромосому. Статус кожної миші визначають шляхом дослідження зразків клітин на присутність гена, для чого застосовують саузернблоттінг. На підставі даних аналізу відбирають трансгенних гетерозиготних тварин, яких потім використовують для схрещування і отримання гомозиготной трансгенної лінії.

Зазвичай включення трансгенів в хромосому відбувається випадковим чином і у вигляді блоку з декількох копій. Важливо, що при включенні трансгенного блоку не утворюється розривів в інших, функціонально важливих генах. Характер експресії трансгенів залежить від ряду факторів. Іноді ці гени виявляються під контролем промоторів загального типу і експресуються в більшості тканин. В інших випадках вони пов'язані з тканеспеціфіческіе промоторами і їх експресія обмежена лише деякими тканинами і клітинами або певними стадіями розвитку. До інтерпретації фенотипу трансгенних тварин необхідно підходити з обережністю, оскільки високу експресію трансгенів в невідповідних тканинах не можна вважати фізіологічною.

Спрямована доставка гена

Цей більш тонкий метод на першому етапі полягає в перенесенні гена, який взаємодіє або рекомбинирует з досліджуваним ендогенних геном і викликає в результаті його зміна. Наприклад, в цьому ендогенному гені може статися делеция, в ньому можуть виникнути точкові мутації або випасти екзон. Такий змінений ген вводять в ембріональну поліпотентні стовбурові клітини, де він рекомбинирует з аналогічним ендогенних геном. Цю стовбурові клітини переносять потім у бластоцисту або імплантують описаним вище способом.



Скачати 17.85 Kb.