Імуноферментний аналіз з посиленою хемілюмінесценції






    Головна сторінка





Дата конвертації29.11.2017
Розмір8.42 Kb.
Типреферат

Імуноферментний аналіз з посиленою хемілюмінесценції


ВСТУП

Визначати ферментну мітку кількісно можна різними методами, наприклад, за допомогою колориметрії, флуориметрії, радіометрії і потенціометрії. Нещодавно для цієї мети стали застосовувати також хемілюмінесценцію або біолюмінесценцію. Ферментні мітки, які можна визначати за допомогою реакцій, що супроводжуються випромінюванням світла, представлені в табл. 1. У загальному випадку чутливість Хемі і біолюмінесцентних методів визначення дуже висока, а якщо використовувати ще і посилення сигналу від ферментної мітки, то чутливість відповідних методик імуноаналізу повинна бути надзвичайно високою. Можливості біолюмінесцентного методу недавно були продемонстровані на прикладі визначення Д-Галак-тозідази. За допомогою сполученої реакції галактозо-дегідроге-наза АОН: РМ№оксідоредуктаза-бактеріальна люціферази вдалося виявити 2 • 10 "22 благаючи / 3-галактозидази.

В якості мітки в иммуноферментном аналізі широко застосовують пероксидазу хрону, методи отримання і стабілізації кон'югатів з якої добре вивчені. Пероксидазу хрону найчастіше визначають колориметрически, але для цієї мети можна також використовувати різні Хемі і біолюмінесцентного реакції.

Детально вивчено визначення пероксидази за допомогою Хемі-люмінесцентної реакції в системі люмінол - пероксид водню, посиленою фенольними сполуками. Такий підхід до визначення активності ферменту має ряд переваг в порівнянні з іншими методами визначення; його основні характеристики перераховані в табл. 2.

Підсилювачі. Здатністю посилювати випромінювання світла в реакції окислення люміналу пероксидом водню, що каталізується пероксидазою, мають різні сполуки, в тому числі 6-гідроксібензотіазоли, наприклад люциферин, феноли, нафтоли і аміни. На рис. 1 зображені структури представників речовин кожного класу. Ступінь посилення випромінювання світла залежить від концентрації реагентів. Типова залежність інтенсивності світіння від концентрації підсилювача в реакції ЛЮМІНА-ла з пероксидом водню, що каталізується пероксидазою і посилюваної 6-гідрокси-бензотіазол, представлена ​​на рис. 2.

Синергізм і ступінь посилення. В системі пероксі-даза - люмінал - пероксид водню спостерігається ефект синьо

ргізма, про що свідчать дані, наведені в табл. 3. На ступінь посилення впливають багато чинників; проте досягнуто посилення випромінювання світла більш ніж в 500 разів. У присутності деяких підсилювачів фонове випромінювання світла в системі люмінол - пероксид водню зменшується. При визначенні активності пероксидази це дозволяє на кілька порядків підвищити відношення сигналу до шуму тільки, за рахунок застосування таких підсилювачів.

Посилення світіння характерно для різних циклічних діацілгідразідов, при дії окислювачів в присутності пероксндази. Посилення не спостерігається в разі деяких речовин з пероксидазною активністю, наприклад гемоглобіну, який каталізує тільки колориметрические реакції. Цей факт свідчить про більш високу специфічність посиленого хемілюмінесцентного аналізу в порівнянні з колориметричною методами. Спектри випромінюваного світла практично однакові в посилених і неусиленном реакціях. Це "говорить про те, що сам по собі підсилювач не випромінює світло.

За відсутності підсилювачів хемілюмінесценція в системі пероксидаза-люмінол-пероксид, мабуть, лімітується щодо повільної реакцією пероксндази, що знаходиться в формі так званого сполуки II, з люмінолом, в результаті якої утворюються люмінольние радикали і регенерується пероксидаза. Підсилювачі, здатні швидко реагувати з таким з'єднанням, можуть збільшувати випромінювання світла, прискорюючи перетворення сполуки II в активну пероксидазу. Продукти перетворення підсилювача можуть потім швидко реагувати з люмінолом, утворюючи додаткові люмінольние радикали і тим самим сприяючи подальшому посиленню випромінювання світла. Підсилювачі можуть впливати і на неактивні пероксидазного інтермедіа ™, наприклад, на з'єднання III.

реагенти

Важливим фактором у визначенні пероксидазною активності за допомогою посиленої хемілюмінесценції є хімічна чистота циклічних діацілгідразідов. Вивчення різних зразків люминола показало, що домішки негативно впливають на випромінювання світла. В результаті фотохімічних і термічних процесів люмінол частково розкладається, а утворюються домішки впливають на кінетику і інтенсивність випромінювання світла. У табл. 4 представлені результати порівняння чистоти і властивостей деяких надходять у продаж препаратів люминола, а також натрієвої солі люминола, очищеної перекристалізацією з розчину гідроксиду натрію.

2. Посилення хемілюмінесцентних імуноаналізу

Посилений хемілюмінесцентний іммуноаналіз з пероксидазою як ферментної мітки застосовували для визначення багатьох з'єднань. Ряд прикладів наведено в табл. 5. У цих імуноаналізу застосовували конкурентні методи і методи з екстракцією імунного комплексу, а також більшість зазвичай використовуваних твердих носіїв. на

а Відношення сигнал / фон при хемілюмінесцентному визначенні пероксидази хрону з посиленням л-іодфенолом; 6 ТШХ - тонкошарова хроматографія.

Мал. 3 представлена ​​схема визначення фоллікулстімулірующего гормону. У цьому методі межа виявлення FSH на мікротітровальних планшеті дорівнює близько 0,01 м.ед. Метод характеризується відмінною воспроизводимостью як в одному аналізі, так і між аналізами.


Метод посиленою хемілюмінесценції успішно застосовувався також для виявлення пероксидазною мітки при вивченні гібридизації ДНК. описано

метод кількісного визначення з використанням фотометра для планшетів і якісного аналізу з застосуванням фотографічного виявлення з чутливістю кілька пикограмм.

прилади

В даний час промисловість випускає кілька типів люмінометр, придатних для вимірювання світла, випромінюваного в реакціях посиленою хемілюмінесценції. Деякі з цих люмінометр були модернізовані спеціально для посиленого хемілюмінесцентного аналізу. Інтенсивність і тривалість випромінювання світла в реакціях з посиленням люмінесценції полегшили створення простих люмінометр, в яких в якості детекторів використовуються кремнієві 'фотодіоди або високочутлива фотографічна плівка. Такі люмінометр відносно недорогі, портативні, і тому їх можна застосовувати і поза лабораторій. В даний час фірма MASTImmunosystems випускає спеціальні фотокамери для хемілюмінесцентний детекції в методі ІФА аллергенспеціфіческіх імуноглобуліну Е. Можна припустити, що в майбутньому будуть створені набори з фотографічною реєстрацією результатів ІФА та інших з'єднань, визначення яких необхідно проводити в клініках, лікарнях або вдома.

Випускаються прилади та набори реагентів.

Набори для посиленого хемілюмінесцентного імуноферментного аналізу і відповідні прилади зараз випускаються під назвою Amerlite фірмою AmershamInternationalpic.


Аналіз виконується на стрипах мікротітровальних планшетів білого кольору, а вимір люмінесценції швидко і автоматично виконує спеціальний люмінометр для мікропланшетів. В даний час випускаються набори для визначення тіроідстімулірующего гормону, хоріогонадотропін людини, карциноембріональний антигену, альфа-фетопротеїну, тироксину, тріїодтіроніна і для визначення індексу вільного тироксину. Ці аналізи мають високу чувст вітальність і прекрасну відтворюваність.


ВИСНОВКИ

Визначення пероксидазною мітки за допомогою посиленої хемілюмінесценції відрізняється високою чутливістю, специфічністю і простотою і може бути покладено в основу при розробці зручних і швидких методів імуноферментного аналізу, що виконуються за допомогою недорогих портативних приладів.


  • Посилення хемілюмінесцентних імуноаналізу