Іммуноаналіз методом підрахунку частинок






    Головна сторінка





Скачати 16.72 Kb.
Дата конвертації02.12.2017
Розмір16.72 Kb.
Типреферат

Іммуноаналіз методом підрахунку частинок


ВСТУП

Агглютінаціонние властивості антитіл відомі вже давно. По суті справи, саме здатність антитіл викликати аглютинацію і привела до відкриття та ідентифікації антитіл. В середині 50-х років ці властивості антитіл були вперше використані Сінгером і Плотц при створенні імуноаналізу з латексної аглютинації. За минулі роки цей метод інтенсивно розвивався і вдосконалювався. Хоча значна частина досліджень була спрямована на розвиток кількісного аналізу, до останнього часу основні досягнення імуноаналізу з латексної аглютинації обмежувалися розробкою методик якісного аналізу, перш за все для контролю вагітності і в серологіі. Розвиток досліджень стримувалося через вплив білків сироватки на результати аналізу і в зв'язку з недостатньою чутливістю методу.

В кінці 70-х років Массою і ін. Вперше описали ряд способів і прийомів, що дозволяють: 1) підвищити чутливість аналізу, 2) усунути специфічні і неспецифічні побічні ефекти, що заважають ходу аналізу, 3) розширити діапазон застосування.

Удосконалення, поєднання і розширення цих способів і прийомів дозволили створити систему гомогенного аналізу - имму-ноаналіз методом підрахунку частинок. Ця глава присвячена опису системи IMPACT і обговоренню основних напрямків її подальшого розвитку.


1. ПРИНЦИПИ АНАЛІЗУ

Основний принцип системи IMPACT дуже простий: іммуноаналіз з латексної аглютинації виконується за допомогою повністю автоматизованого комплексу, що здійснює всі операції і обробку даних. Після інкубації реакційна суміш розбавляється і потім пропускається через проточну кювету оптичного лічильника часток. Лічильник підраховує тільки неагглютінірованние частки, а комп'ютер за допомогою отриманих даних будує калібровану криву і знаходить концентрацію визначається речовини в клінічних пробах.

Коллімірованний промінь світла, сфокусований до діаметра 7,5 мкм, проходить через проточну кювету і потрапляє на чорну пляму. Якщо світло зустрічає на своєму шляху частинки, то останні розсіюють світло так, що він проходить повз плями і потрапляє на колектор. Інтенсивність світла вимірюється фотоумножителем, вихід якого підключений до простого аналізатору висоти імпульсу. Імпульси, що відповідають окремим частинкам, підраховуються і аналізуються. Імпульси від фонового шуму або полімерних частинок не враховуються.

Антигени кількісно визначають шляхом змішування проби сироватки, плазми, цереброспинальной рідини або сечі з суспендованих в буфері латексними частинками діаметром 0,8 мкм, на які нанесені антитіла. Антигени з проби агглютинируют деякі такі частинки, знижуючи тим самим число залишилися частинок .. Отже, концентрація антигену повинна бути обернено пропорційній числу неагтлюті-лося раніше частинок.

Аналогічно визначають антитіла, здатні агглютинировать латексні частинки, на які нанесені антигени. Агглютинируют активність антитіл імуноглобуліну Gможно посилити ревматоїдним фактором IgM. RF вигідно відрізняється від антисироватки проти імуноглобулінів тим, що не вимагає операції промивки для видалення незв'язаних імуноглобулінів. Нездатність деяких антигенів, наприклад фосфоліпази А2 - алергену бджолиної отрути і антигену вірусу Herpessimplex, до солюбилизации може привести до неспецифическому зв'язування імуноглобулінів. Це джерело помилок можна усунути за допомогою частинок латексу, на які нанесені антитіла. Такі частинки агглютинируют в присутності антигену. Тоді досліджувані антитіла можна визначати титруванням, скориставшись їх здатністю пригнічувати аглютинацію.

Імунні комплекси (рис.1) визначають по агглютинируют активності RF або мишачих Clq по відношенню до латексних частинок, покритим IgG. Імунні комплекси, що зв'язують агглютінмрующій агент, зменшують ступінь аглютинації латексу. Отже, концентрація імунних комплексів пропорційна концентрації неагглютінірованник частинок (рис.2).


Гаптени визначають за допомогою частинок латексу, на teoroptte нанесені молекули гаптена і антитіл IgG проти гаптена (рис.3). Утворений комплекс агглютинирует присутності RF людини.

Якщо в пробі міститься вільний гаптен, він конкурує з кон'югатом гаптен-латекс за центри зв'язування антитіл IgG і тому пригнічує агглютинацию, що призводить до збільшення числа неагглютінірованних частинок. Концентрація гап-тена пропорційна числу неагглютінірованних частинок.

2. УСУНЕННЯ ПОБІЧНІ ЕФЕКТІВ СИРОВАТКИ

Аглютинації можуть заважати багато факторів. Вони зазвичай призводять до небажаної самоагглютінаціі, ступінь якої змінюється від проби до проби. Для усунення відповідних ефектів розроблений ряд методик, верб конкретних аналізах речовин одна або кілька таких методик зазвичай обов'язкові.

Неспецифічні ефекти можуть бути обумовлені нестійкістю будь-яких латексних суспензій, навіть якщо на поверхню частинок не нанесено ніяких речовин. Ці ефекти знижуються при ретельному підборі буферних розчинів, що пов'язуються з частинками білків, і характеристик частинок, в тому числі полярності і 'щільності поверхневого заряду. Іонна сила буферних розчинів повинна забезпечувати приблизно нейтральний результуючий поверхневий заряд.

Антитіла або кон'югати гаптенов з білками зв'язуються з частинками ковалентно, а що залишилися незайняті ділянки поверхні частинок потім насичуються баластними білками для зменшення гідрофобної взаємодії між частинками.

Специфічні ефекти, зумовлені наявністю RF або Clq в пробах сироватки або антіідіотіпіческіх антитіл в поліклональних антисироватки, можна усунути різними прийомами. Відповідні приклади представлені на рис. 4 і 5. Схема послідовного усунення різних ефектів в разі спроби невизначеного складу при визначенні феритину представлена ​​на рис. 4. Відомий ряд операцій, що дозволяють спростити методики. У багатьох випадках, наприклад при визначенні тироксину, тріїодтіроніна, поверхневого антигену гепатиту В, ^ імуноглобуліну Е і го-надотропіна людини, попередня обробка проби пепсином усуває побічні ефекти сироватки, не руйнуючи визначається речовина або перетворюючи його в сполуки, що зберігають імунологічну активність. На рис. 5 як приклад представлена ​​схема визначення тіротропіна, в якій для усунення впливу білків сироватки на результати аналізу застосований цей підхід.

Для підвищення швидкості реакції всі аналізи проводять при 37 ° С в термостаті з перемішуванням. Реакцію здійснюють в пробірках 12 х 55 мм, що обертаються зі швидкістю 1550 об / хв з відхиленням від осі обертання на 2,00 мм. Таке перемішування забезпечує необхідну частоту зіткнень і орієнтацію комплексів частинок з обумовленою речовиною по відношенню до не-прореагував часткам, в результаті чого утворюються термодинамічно більш стійкі асоціати. При використанні по-ліклональной антисироватки таке перемішування може підвищити специфічність антитіл шляхом руйнування нестійких ас-соціатов, що утворюються в результаті перехресних реакцій.

3. ЗАСТОСУВАННЯ

Іммуноаналіз з підрахунком частинок знаходить все більш широке застосування. Вже опубліковано понад 80 робіт, а також детальний огляд.

Деякі речовини, що визначаються за допомогою імуноаналізу з підрахунком частинок

обумовлений речовина

Полівалентні антигени: Альфа-фетопротеїн С-реактивний білок Ферритин Лактоферрнн S-100

Специфічний глікопротеїн на вагітність

IgE

IgA

IgM

Підкласи IgG й IgA ТЗГ тіроглобуліна тіротропного гормон плацентарного лактогену людини / J-Субодиниця хоріогоіадотропіна людини / J-Мікроглобулін Ретінолсвязьшающія білок Кансулярний антиген Н.influenzaeКапсулярние антигени StreptococcuspneumoniaeАнтігени StreptococcushaemofyueusМоновалентние антигени:

тироксин

Трінодтіронін

дигоксин

Антитіла: Ревматоїдний фактор Блокуючі антитіла проти отрути бджіл Антитіла проти BrucellaabortusСпеціфіческіе антитіла IgE антитіла проти основного білка мієліну Антитіла проти тіроглобуліна Антитіла проти правця Антитіла проти простого ііруса герпесу типу 1

Імунні комплекси:

Виявлення з ревматоїдним фактором

Виявлення з мишачими Clq-ков, гаптенов, антитіл і імунних комплексів, які визначаються цим методом. В даний час тринадцять наборів реагентів для виконання таких аналізів виробляються в промисловому масштабі і надходять у продаж.


4. НОВІ ГАЛУЗІ ВИКОРИСТАННЯ

У цьому розділі будуть розглянуті не публікувалися раніше результати двох досліджень, що ілюструють можливості та ефективність методу. Деталі цих досліджень будуть незабаром опубліковані. У першому дослідженні для вивчення розвитку інфекції Brucellaarbortusподопитних тварин заражали цими організмами і забивали партіями по чотири миші через певні проміжки часу. Як показано на рис. 6, основним критерієм розвитку інфекції може служити число утворюються колоній. Паралельно за ступенем ін-гібірующей активності визначали ліпополісахарідние антигени, а також циркулюючі імунні комплекси і сумарна кількість антитіл. Неважко бачити, що між CFU і кількістю LPS-антигенів існує хороша кореляція. Збільшення в часі концентрації антитіл і циркулюючих імунних комплексів визначає імунний статус. Ці дослідження в даний час переносяться на велику рогату худобу і на людину з тим, щоб результати можна було використовувати в діагностиці і при лікуванні.

У другому дослідженні показана можливість застосування методу для вимірювання дуже низьких концентрацій білків. У тиро-идной ендокринології постійно відчувається потреба в високочутливих методиках визначення тіроідстімулірующего гормону. Такі методики дозволяли б надійно відрізняти хворих тиротоксикоз, а також мікседемою від здорових людей. Більш того, при гострих еутотіроідних синдромах такі методики менш проблематичні, ніж визначення вільного тироксину, оскільки на їх результати не впливають сторонні речовини, часто присутні в сироватці хворих, які страждають цими захворюваннями.

На рис. 8 представлена ​​схема першого гомогенного високочутливого методу визначення TSH; завдяки одночасовой інкубації це найшвидший з описаних до теперішнього часу методів визначення TSH в сироватці людини. У ньому використовуються два типи моноклональних антитіл на різних латексах. Межа виявлення і калібрувальна крива представлені на рис. 9.

Попередні результати дослідження сироватки групи здорових людей і групи хворих тиротоксикоз представлені на рис. 10. Результати аналізу дозволяють чітко розрізнити ці дві групи. У гіпертіроідной групі виявився один пацієнт з Т 3 -токсікозом, у якого концентрація TSH перевищила межу виявлення. Тироїдний статус цього пацієнта точно невідомий.


Аналогічні результати визначення TSH пізніше були отримані методом радіоіммуноаналіза з набором реагентів BehringHS-TSH.Ймовірно, цей пацієнт помилково було включено до групи хворих тиротоксикоз.

5. ЧУТЛИВІСТЬ МЕТОДУ

З наведених вище даних видно, що визначення TSH в сироватці людини за допомогою методу IMPACT дозволяє в 10 -1000 раз підвищити чутливість в порівнянні з турбідімет-рическим імуноаналізу з латексної аглютинації. За чутливості описаний метод можна порівняти з іммунорадіометріческім аналізом і перевершує флуоресцентний, хемілюмінес-процентним або ферментний іммунометріческіе методи аналізу.

Як показано на рис. 11, в методі IMPACT -використовується надлишок антитіл. Однак за своїми характеристиками метод IMPACT розташовується швидше між власне іммунометріче-ськими методами і конкурентним імуноаналізу, причому зв'язування антигену з антитілом, можливо, посилюється за рахунок безлічі слабких взаємодій.



Фізичні основи методу складні і поки ще не до кінця вивчені. Чутливість аналізу визначається: 1) числом частинок, 2) поверхневою щільністю антитіл або антигену, 3) константою зв'язування антитіл, 4) можливо, псевдоконстантой зв'язування антитіл, 5) похибкою Пуассона при підрахунку частинок в потоці, що проходить через осередок.


Чутливість методу можна збільшити приблизно в 100 разів, якщо підраховувати агглютініровалісь частки. При цьому повинна також усуватися компонента похибки Пуассона, обумовлена ​​фоном неагглютінірованних частинок. Підрахунок агглютінірованних частинок досить складний. Відносний вміст визначаються димарів, тримерів, тетрамеров і вищих оліго- мерів залежить від природи досліджуваного речовини і від його концентрації. Прототип детектора з високою роздільною здатністю розроблений фірмою AcadeDiagnosticSystems і призначений для визначення альфа-фетопротеїну методом IMPACT. Для вирішення проблеми складного характеру аглютинації детектор, функціонуючи в кінетичному режимі, визначав тільки димер. Таким шляхом всього за 4 хв вдалося з високою чутливістю визначити концентрацію димера перш, ніж встигли утворитися помітні кількості вищих олігомерів.

6. ПЕРСПЕКТИВИ РОЗВИТКУ

Система IMPACT знаходиться в такій стадії розвитку, коли вже створена міцна основа для подальшого вдосконалення шляхом розширення кола визначених речовин і різноманітності методик. У цьому контексті вимальовуються три основні шляхи розвитку системи: 1) визначення нових речовин, 2) вдосконалення хімічних процесів, 3) вдосконалення приладів.

Визначення нових речовин. Широка сфера застосування методу дозволяє використовувати його для визначення практично будь-якого нового речовини. В даний час розробляються методики визначення антигенів вірусу імунного дефіциту людини і антитіл до нього, факторів коагуляції, специфічних алергенів. Поки ще не вивчалася можливість визначення речовин за допомогою специфічних зв'язуючих білків, а не антитіл. В принципі систему IMPACT можна використовувати і для визначення речовин за допомогою таких зв'язуючих білків.

Удосконалення иммунохимических процесів. Застосування моноклональних антитіл, наприклад при визначенні TSH, підвищує специфічність. Усунути побічні ефекти, пов'язані з надлишком антигена, можна шляхом відповідного картування епітопів. Очікується, що метод може знайти застосування і в молекулярній біології.

Удосконалення приладів. В середині 1987 р фірмою AcadeDiagnosticSystemS.A. розпочато випуск нової компактної модульної напівавтоматичного системи MULTIPACT. Вона складається з високопродуктивного лічильника часток, термостата і пристрої для додавання і розведення проб і розчинів реагентів. Будуть випускатися також набори реагентів для визначення наступних 6 речовин: Т 4, Т 3, тірок-сінсвязивающего глобуліну, TSH, дигоксину і c-hCG. У наборах для визначення TSH і /? - hCG використовуються моноклінальние антитіла.

Аналогічні системи третього покоління, ймовірно, будуть мати більшу продуктивністю, здатністю швидко працювати в кінетичному режимі і визначати агглютініровалісь частки.


ВИСНОВКИ

Після порівняно тривалого періоду становлення іммуноаналіз з підрахунком частинок досяг такого стану, коли 1) його чутливість не поступається чутливості інших кращих конкурентних методів імуноаналізу, 2) на результати аналізу майже не впливають жодні сторонні речовини в пробі, 3) по продуктивності, дешевизні і ступеня автоматизації він не має собі рівних.

Сучасна промисловість здатна виробляти дешеві напівавтоматичні прилади, призначені для проведення аналізів в невеликих лабораторіях, а також повністю автоматизовані, швидкодіючі аналізатори для великих клінік або контрольних лабораторій. Більш того, окремі операції можуть знайти застосування і в інших системах, наприклад в автоматичних клінічних анализаторах, що працюють на принципі реєстрації кінетики турбідиметрії. Звісно ж цілком імовірним, що система IMPACT або будь-якої її аналог зіграють одну з найважливіших ролей при переході до методів імуноаналізу без застосування радіоактивних ізотопів як в клінічній діагностиці, так і в наукових дослідженнях.



Скачати 16.72 Kb.