Іммобілізовані БАС як основа створення ЛФ нового покоління. Приклади носіїв. методи






    Головна сторінка





Скачати 19.76 Kb.
Дата конвертації15.12.2017
Розмір19.76 Kb.
Типреферат

Алтайський державний медичний університет

Кафедра фармацевтичної технології

реферат

"Іммобілізовані БАС як основа створення ЛФ нового покоління. Приклади носіїв. Методи"

підготувала:

Прасолова Ю., 452 гр.

Перевірила: Таликова Н.М.

Барнаул 2010


Ферменти - речовини білкової природи і тому нестійкі при зберіганні, а також чутливі до теплових впливів. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі в відділенні їх від реагентів і продуктів реакції. Вирішити ці проблеми допомагає створення іммобілізованих ферментів. Початок цьому методу було покладено в 1916 році, коли Дж.Нельсон і Е.Гріффін адсорбувати на вугіллі инвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність. Сам термін "іммобілізовані ферменти узаконений в 1971 році, і означає будь-яке обмеження свободи пересування білкових молекул в просторі.

Сутність іммобілізації ферментів - прикріплення їх в активній формі до нерозчинної основі або висновок в напівпроникну мембранну систему. Прикріплення ферменту до носія здійснюється адсорбционно, хімічним зв'язком або шляхом механічного включення ферменту в органічний або неорганічний гель (в капсулу і т. П.). При цьому допускається прикріплення ферменту тільки за рахунок функціональних груп, що не входять в активний центр і не беруть участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту або матриця може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин, порожніх волокон, трубочок, капсул і т. Д. Має значення розмір частинок носія. Важливо мати велику поверхню, тому рекомендуються невеликі частинки діаметром 0,1-0,2 мм. Носій ферменту може бути як природна речовина, так і синтетичний полімер.

Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:

1. Гетерогенний каталізатор легко відокремимо від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використовувати фермент повторно, а також отримувати чистий від ферменту продукт.

2. Ферментативний процес з використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безперервно, регулюючи швидкість каталізуються реакції і вихід продукту.

3. Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо щодо макромолекулярної субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу і інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.

4. Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло і звук. Иммобилизовать ферменти можна як шляхом зв'язування на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньомолекулярної або міжмолекулярної зшивання білкових молекул низькомолекулярними біфункціонального сполуками, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.

Класифікація носіїв для ферментів

Для отримання іммобілізованих ферментів використовується обмежене число як органічних, так і неорганічних носіїв. До носіїв ставляться такі вимоги (Дж.Порат, 1974):

· Висока хімічна та біологічна стійкість;

· Висока хімічна міцність;

· Достатня проникність для ферменту і субстратів, пористість, велика питома поверхня;

· Можливість отримання у вигляді зручних в технологічному відношенні форм (гранул, мембран);

· Легка активація;

· Висока гідрофільність;

· Невисока вартість.

Класифікація носіїв схематично представлена ​​на малюнку 1


Рис1 Класифікація носіїв для іммобілізованих ферментів

Слід зазначити, що органічні носії (як низько-, так і високомолекулярні) можуть бути природного або синтетичного походження. Природні полімерні органічні носії ділять відповідно до їх біохімічної класифікацією на 3 групи: полісахаридні, білкові і ліпідні.

Синтетичні полімери також можна розділити на групи в зв'язку з хімічною будовою основного ланцюга макромолекул: поліметіленовимі, ​​поліамідні, поліефірні.

Для іммобілізації ферментів найбільш широко використовуються природні полісахариди і синтетичні носії поліметільного типу, решта застосовуються значно рідше. Велике значення природних полімерів в якості носіїв для іммобілізації пояснюється їх доступністю і наявністю реакційно-здатних функціональних груп, легко вступають в хімічні реакції. Характерною особливістю цієї групи носіїв також є їх висока гідрофільність. Нестача природних полімерів - нестійкість до впливу мікроорганізмів і досить висока вартість.

Найбільш часто для іммобілізації використовуються такі полісахариди, як целюлоза, декстран, агароза і їх похідні. Целюлоза гідрофільна, має багато гідроксильних груп, що дозволяє модифікувати її, заміщаючи ці групи. Для збільшення механічної міцності целюлозу гранулюють шляхом часткового гідролізу, в результаті якого руйнуються аморфні ділянки. На їх місце для збереження пористості між кристалічними ділянками вводять хімічні зшивання. Гранульовану целюлозу досить легко перетворити в різні іонообмінні похідні, такі як ДЕАЕ-целюлоза, КМЦ і т.д.

Широко поширені носії на основі декстрану, що випускаються під назвою "сефадексе". При висушуванні вони легко стискаються, в водному розчині сильно набухають. У цих носіях розмір пір в гелі регулюється ступенем сшітості. До групи декстранів відносять і крохмаль. Хімічно модифікований крохмаль зшивається агентами, такими як формальдегід. Таким способом було отримано губчастий крохмаль, що володіє підвищеною стійкістю по відношенню до ферментам, гідролізу. Водорозчинні препарати на основі декстрану часто застосовуються як носії лікарських засобів в медицині.

Якісними носіями вважається агар. Його властивості поліпшуються після хімічної зшивання, наприклад, діепоксіднимі сполуками. Такий агар стає стійким до нагрівання, міцний, легко модифікується.

Білки в якості носіїв мають ряд переваг: місткі, здатні до біодеградації, можуть застосовуватися в якості тонкої (товщиною 80 мкм) мембрани. Іммобілізацію ферментів на білкових носіях можна проводити як під час відсутності, так і в присутності сшивающих агентів. Білки використовуються і в фундаментальних біологічних дослідженнях, і в медицині. До недоліків білків в якості носіїв відносять їх високу імуногенність (за винятком колагену і фібрину). Найбільш для іммобілізації використовуються структурні (кератин, фібрин, колаген), рухові (міозин) і транспортні (альбумін) білки.

Синтетичні полімерні носії застосовуються для ковалентного і сорбційної іммобілізації ферментів, для отримання гелів, мікрокапсул. Полімери на основі стиролу застосовуються сорбційної іммобілізації. Вони можуть мати макропористі, ізопорістую структуру, а також гетеропорістую структуру. Для отримання полімерних гідрофільних носіїв широко використовується акриламід - похідне акрилової кислоти.

Широке поширення набув метод включення ферментів і клітин в поліакріламідний гель, який має жорстку просторову сітчасту структуру. Поліакріламідний гель стійкий до хімічних впливів. Дуже цікаву групу представляють поліамідні носії. Це групи різних гетероланцюгових полімерів з повторюється амидной групою -С (О) -NH-. Наприклад, полімери на основі N-вінілпіролідону використовуються для отримання іммобілізованих ферментів, здатних повільно розпадатися в організмі. Крім того, вони біологічно інертні, що особливо важливо при використанні в медичних цілях. Істотним недоліком більшості полімерних носіїв є їх здатність накопичуватися в організмі. В цьому відношенні перевага віддається природним полімерів, які гідролізуються ферментами. Тому до складу лікарських препаратів часто входить декстран, а з синтетичних носіїв - полімери на основі N-вінілпіролідону. В даний час ведуться експерименти по створенню синтетичних полімерів, що розщеплюються з утворенням нетоксичних продуктів обміну.

Методи іммобілізації ферментів

Існує два основні методи іммобілізації ферментів: фізичний і хімічний.

Фізична іммобілізація ферментів є включення ферменту в таке середовище, в якій для нього доступною є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичної іммобілізації фермент не пов'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів:

- адсорбція на нерозчинних носіях;

- включення в пори гелю;

- просторове відділення ферменту від решти обсягу реакційної системи за допомогою напівпроникною перегородки (мембрани);

- включення в двофазну середу, де фермент розчинний і може знаходитися тільки в одній з фаз.

Перераховані підходи проілюстровані малюнку 2.

Мал. 2. Способи іммобілізації ферментів: а - адсорбція на нерозчинних носіях, б - включення в пори гелю, в - відділення ферменту за допомогою напівпроникною мембрани, г - використання двофазної реакційного середовища

Адсорбційна іммобілізація є найбільш старим з існуючих способів іммобілізації ферментів, початок їй було покладено ще в 1916 р Цей спосіб досить простий і досягається при контакті водного розчину ферменту з носієм. Після відмивання неадсорбованими білка іммобілізований фермент готовий до використання. Утримання адсорбированной молекули ферменту на поверхні носія може забезпечуватися за рахунок неспецифічних ван дер Ваальсових взаємодій, водневих зв'язків, електростатичних і гідрофобних взаємодій між носієм і поверхневими групами білка. Внесок кожного з типів зв'язування залежить від хімічної природи носія і функціональних груп на поверхні молекули ферменту. Взаємодії з носієм можуть виявитися настільки сильними, що сорбція биокатализатора може супроводжуватися руйнуванням його структури. Наприклад, при адсорбції деяких рослинних клітин на гранулах цітодекса клітинна стінка деформується, повторюючи рельєф поверхні частинок носія. Перевагою методу адсорбційної іммобілізації є доступність і дешевизна сорбентів, які виступають в ролі носіїв. Їм також можна надати будь-яку конфігурацію і забезпечити необхідну пористість. Важливим фактор - простота застосовуваних методик. При адсорбционном зв'язуванні можна вирішити і проблему очищення ферменту, так як зв'язування білка з носієм в багатьох випадках досить специфічне. На жаль, міцність зв'язування ферменту з носієм не завжди достатньо висока, що обмежує застосування методу. До недоліків адсорбційної іммобілізації слід віднести відсутність загальних рекомендацій, що дозволяють зробити правильний вибір носія та оптимальних умов іммобілізації конкретного ферменту.

Деяких з перерахованих труднощів можна уникнути при іммобілізації ферментів шляхом включення в гелі. Суть цього методу іммобілізації полягає в тому, що молекули ферменту включаються в тривимірну сітку з тісно переплетених полімерних ланцюгів, що утворюють гель. Середня відстань між сусідніми ланцюгами в гелі менше розміру молекули включеного ферменту, тому він не може покинути полімерну матрицю і вийти в навколишній розчин, тобто знаходиться в іммобілізованим стані. Додатковий внесок в утримування ферменту в сітці гелю можуть вносити також іонні і водневі зв'язку між молекулою ферменту і оточуючими її полімерними ланцюгами. Простір між полімерними ланцюгами в гелі заповнене водою, на частку якої зазвичай припадає значна частина всього обсягу гелю. Наприклад, широко застосовуються гелі полімерів акрилової кислоти в залежності від концентрації полімеру і його природи містять від 50 до 90% води.

Для іммобілізації ферментів в гелі існує два основних способи.При одному з них фермент поміщають у водний розчин мономера, а потім проводять полімеризацію, в результаті чого утворюється полімерний гель з включеними в нього молекулами ферменту. У реакційну суміш часто додають також біфункціональні (містять в молекулі два подвійні зв'язки) зшивають агенти, які надають утворюється полімеру структуру тривимірної сітки. В іншому випадку фермент вносять в розчин готового полімеру, який потім якимось чином переводять в гелевидний стан. Спосіб іммобілізації ферментів шляхом включення в полімерний гель дозволяє створювати препарати будь-якої геометричної конфігурації, забезпечуючи при цьому рівномірний розподіл биокатализатора в обсязі носія. Метод універсальний, застосуємо для іммобілізації практично будь-яких ферментів, поліферментних систем, клітинних фрагментів і клітин. Фермент, включений в гель, стабільний, надійно захищений від інактивації внаслідок бактеріального зараження, так як великі клітини бактерій не можуть проникнути в дрібнопористу полімерну матрицю. У той же час, ця матриця може створювати значні перешкоди для дифузії субстрату до ферменту, знижуючи каталітичну ефективність іммобілізованого препарату, тому для високомолекулярних субстратів даний метод іммобілізації не застосовують взагалі.

Загальний принцип іммобілізації ферментів з використанням мембран полягає в тому, що водний розчин ферменту відділяється від водного розчину субстрату напівпроникною перегородкою. Напівпроникна мембрана легко пропускає невеликі молекули субстрату, але нездоланна для великих молекул ферменту. Існуючі модифікації цього методу розрізняються лише способами отримання напівпроникною мембрани і її природою. Водний розчин ферменту можна включати всередину мікрокапсул, що представляють собою замкнуті сферичні пухирці з тонкої полімерної стінкою (микрокапсулирование). При подвійному емульгуванні виходить водна емульсія з крапель органічного розчину полімеру, що містять, в свою чергу, ще більше дрібні краплі водного розчину ферменту. Через деякий час розчинник твердне, утворюючи сферичні полімерні частинки з іммобілізованим в них ферментом. Якщо замість водонерозчинного твердне полімеру використовуються рідкі вуглеводні з високою молекулярною масою, метод називається іммобілізацією шляхом включення в рідкі мембрани. До модифікаціям методу іммобілізації ферментів з використанням напівпроникних оболонок відносяться також включення в волокна (при цьому замість крапель, що містять ферменти, виходять нитки) і включення в ліпосоми. Застосування систем мембранного типу дозволяє отримувати іммобілізовані препарати з високим вмістом ферменту. Метод, як і попередній, досить універсальний, тобто застосуємо як ферментам, так і до клітин, а також їх фрагментів. Завдяки високому відношенню поверхні до об'єму і малій товщині мембрани вдається уникнути значних дифузійних обмежень швидкості ферментативних реакцій. Основний недолік мембранних систем - неможливість ферментативного перетворення високомолекулярних субстратів.

При іммобілізації ферментів з використання систем двофазного типу обмеження свободи переміщення ферменту в обсязі системи досягається завдяки його здатності розчинятися тільки в одній з фаз. Субстрат і продукт ферментативного перетворення розподіляються між обома фазами відповідно до їх розчинність в цих фазах. Природа фаз підбирається таким чином, що продукт накопичується в тій з них, де фермент відсутній. Після завершення реакції цю фазу відокремлюють і беруть із неї продукт, а фазу, що містить фермент, знову використовують для проведення чергового процесу. Одним з найважливіших переваг систем двофазного типу є те, що вони дозволяють здійснювати ферментативні перетворення макромолекулярних субстратів, які неможливі при застосуванні жорстких носіїв з обмеженим розміром пір.

Головною відмінністю хімічних методів іммобілізації є те, що шляхом хімічної взаємодії на структуру ферменту в його молекулі створюються нові ковалентні зв'язки, зокрема між білком і носієм. Препарати іммобілізованих ферментів, отримані із застосуванням хімічних методів, мають принаймні двома важливими достоїнствами. По-перше, ковалентний зв'язок ферменту з носієм забезпечує високу міцність утворюється кон'югату. При широкому варіюванні таких умов, як рН і температура, фермент не десорбується з носія і не забруднює цільових продуктів катализируемой їм реакції. Це особливо важливо при реалізації процесів медичного та харчового призначення, а також для забезпечення стійких, відтворюваних результатів в аналітичних системах. По-друге, хімічна модифікація ферментів здатна приводити до істотних змін їх властивостей, таких як Субстратна специфічність, каталітична активність і стабільність. Хімічна іммобілізація ферментів є мистецтвом, рівень якого визначається, в першу чергу, умінням експериментатора. Основне завдання експериментатора полягає у формуванні нових ковалентних зв'язків в молекулі ферменту при використанні його функціональних груп, несуттєвих для прояву його каталітичної активності. При хімічній модифікації ферменту його активний центр бажано захищати. При зіставленні різних прийомів іммобілізації хімічні методи для великомасштабних біотехнологічних процесів здаються малопривабливими через складність і дорожнечу. У промислових процесах зазвичай використовуються ті чи інші методи фізичної іммобілізації.

застосування іммобілізованнихферментов

Особливо відчутний внесок іммобілізовані ферменти внесли в тонкий органічний синтез, в аналіз, в медицину, в процеси конверсії енергії, в харчову і фармацевтичну промисловості.

Для синтетичної органічної хімії важливо те, що в двофазних реакційних середовищах фермент зберігає каталітичну активність навіть при виключно малому вмісті води, тому рівновага каталізуються реакції (вихід продукту) експериментатор може регулювати в широких межах, підбираючи потрібний органічний розчинник. Іммобілізовані ферменти дали поштовх до створення принципово нових методів "безреагентного" безперервного аналізу багатокомпонентних систем органічних (в ряді випадків і неорганічних) сполук.

В майбутньому важливу роль у контролі навколишнього середовища і в клінічній діагностиці повинні зіграти такі методи, як БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ аналіз і імуноферментний аналіз.

У медицині іммобілізовані ферменти відкрили шлях до створення лікарських препаратів пролонгованої дії зі зниженою токсичністю і алергенність. Иммобилизационной підходи сприяють вирішенню проблеми спрямованого транспорту ліків в організмі.

Проблеми біоконверсії маси і енергії в даний час намагаються вирішити мікробіологічними шляхом. Проте іммобілізовані ферменти вносять суттєвий вклад в здійснення фотолиза води і в біоелектрокаталіз.

Заслуговує уваги і використання іммобілізованих ферментів в процесах переробки лігноцелюлозної сировини.

Іммобілізовані ферменти можуть використовуватися і як підсилювачі слабких сигналів. На активний центр иммобилизованного ферменту можна подіяти через носій, піддаючи останній ультразвукової обробки, механічних навантажень або фотохімічним перетворенням. Це дозволяє регулювати каталітичну активність системи фермент - носій під дією механічних, ультразвукових і світлових сигналів. На цій основі було створено механо-і звукочувствітельние датчики і відкритий шлях до безсрібного фотографії.

Промислові процеси із застосуванням іммобілізованих ферментів впроваджені насамперед в харчову і фармацевтичну промисловість. У харчовій промисловості за участю іммобілізованих ферментів йдуть процеси отримання глюкозо-фруктових сиропів, глюкози, яблучної і аспарагінової кислоти, оптично активних L- амінокислот, дієтичного безлактозную молока, цукрів з молочної сироватки та ін.

У медицині іммобілізовані ферменти використовуються також як лікарські препарати, особливо в тих випадках, коли необхідно локальне вплив. Крім того, біокаталізатори широко використовуються в різних апаратах для перфузионной очищення різних біологічних рідин. Можливості та перспективи використання в медицині ферментів в іммобілізованим стані набагато ширше, ніж досягнуті на сьогоднішній день, саме на цьому шляху медицину чекає створення нових високоефективних методів лікування.



Скачати 19.76 Kb.