Ефект, обумовлені введенням у Клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини






    Головна сторінка





Скачати 55.56 Kb.
Дата конвертації01.12.2017
Розмір55.56 Kb.
Типреферат

Н АЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ молекулярної біології ТА ГЕНЕТИКИ

ГІЛЬЧУК Юлія Миколаївна

УДК 577.21: 577.213.3: 577.215

577.217: 577.218

Ефект, ОБУМОВЛЕНІ Введення У Клітини ССАВЦІВ трансгени АПОЛІПОПРОТЕЇНУ А-1 ЛЮДИНИ

03.00.22 - молекулярна генетика

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступенів

кандидата біологічних наук

Київ - 2008


Дісертацією є рукопис.

Роботу виконан у відділі регуляторних механізмів Клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України, академік АМН України

Кордюм Віталій Арнольдович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу регуляторних механізмів Клітини.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Строковська Людмила Іванівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімічної генетики;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович,

Інститут геронтології АМН України, керівник лабораторії молекулярної та клітінної біології.

Захист дисертації состоится «24» червня 2008 р. про 10 годіні на засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дісертацією можна ознайомітісь у Бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано «24» травня 2008 року.

вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останні роки інтенсівно розвіваються дослідження, Які спрямовані на корекцію питань комерційної торгівлі генетичних дефектів введенням цільовіх генів у Клітини реціпієнта - Генна терапія (ГТ) (Vermaetal., 2005). ГТ, як напрямок, сформувалася на перетіні молекулярної генетики та медицини и спочатку булу зосереджена на лікуванні Спадкового моногенних захворювань, таких, як дефіціт аденозіндезаміназі, муковісцидоз, гемофілія, дефіціт α-1 антитрипсину та других (Patiletal., 2005). На сегодня генно-терапевтічні дослідження ширше на полігенні та Інфекційні захворювання; более 60% клінічніх випробувань ГТ стосують терапії злоякісніх пухлина, велика Кількість зусіль спрямована на лікування синдрому Набутів імунодефіціту (Edelsteinetal., 2007). Для медичного использование схвалено перший препарат «Gendicine» (SiBiono Genetech, Китай) (Pangetal., 2005) для лікування різніх форм раку.

Прикладом полігенного захворювання, для которого інтенсівно Розробляють схеми генно-терапевтічної корекції на стадії доклінічніх ДОСЛІДЖЕНЬ, є атеросклероз. Атеросклероз - Одне Із найпошіренішіх захворювань в мире, проявити которого є звуження Просвіту Судін внаслідок Порушення метаболізму ліпідів та, як наслідок, обмеження кровообігу до жіттєво важлівіх ОРГАНІВ (Оганов і співавт., 2002). Дерло кандидатом для ГТ атеросклерозу людини є ген основного Білка ліпопротеїдів вісокої Густиня (ЛПВГ) - аполіпопротеїну А-1 (АРОА1) (Eckardsteinetal., 2001).

Основними проблемами як для підходів генно-терапевтічної корекції атеросклерозу, так и загаль для ГТ, є необходимость Підвищення ефектівності та трівалості Функціонування в організмі рекомбінантніх векторів, Які містять терапевтичний ген, зниженя їхньої токсічності, імуногенності та других можливий негативних ефектів.

Для доставки гена АРОА1 людини in vivo Вже вікорістовувалі рекомбінантні вірусні вектори, що комплекси плазмід Із такими носіями, як модіфікованій полі-L-лізин, ліпосомі та інше. У роботах (Okaetal., 2007; Lebherzetal., 2007) авторами з Використання рекомбінантніх аденовірусніх векторів (рад) та векторів на основе адено- асоційованого вірусу (Рахав) показано можлівість забезпечення високого уровня синтезу АРОА1 людини у піддослідніх мишей, Який утрімувався после одноразове введення вектора почти два года. У тій же година,! Застосування віщезазначеної системи радий векторів для ГТ атеросклерозу на кролях продемонструвало низьких ефективність (Snoeysetal., 2007; Lievensetal., 2004). Використання рекомбінантніх вірусніх векторів для повторювання Введення цільового гена часто неефективно через продукування нейтралізуючіх Антитіл (Monhanetal., 2000; Amalfitanoetal., 2002). Кроме того, Безпечність использование вірусніх векторів є Нагальне проблемою.Більше ГТ та Робить актуальним розробка самє невірусніх ЗАСОБІВ доставки цільовіх генів.

З Іншого боку, спроба доставки цільової ДНК з геном АРОА1 людини в організм мишей з Використання таких носіїв, як галактолізованій полі-L-лізин (діжі і співавт., 2001; Перевізників і співавт., 1997), забезпечен низьких рівень експресії трансгена, хоча Було показано ефективність повторних ін'єкцій препаратів. Введення гідродінамічною ін'єкцією плазмідної ДНК вдалось досягнуть у десятки разів ВИЩОГО уровня експресії АРОА1 людини у піддослідніх тварин (Акиф і співавт., 2004) порівняно з зазначеним Ранее носіями. Однако, зазначеним метод переносу ДНК є небажаним для ГТ атеросклерозу людини, особливо, для пацієнтів Із серцево-судинна захворюваннямі.

Одним Із найефектівнішіх носіїв для доставки плазмідніх векторів in vivo є поліетіленімін (ПЕІ) (Boussifetal., 1995). Однако, при введенні комплексів ДНК / ПЕІ внутрішньовенною ін`єкцією експресію трансгена віявляють в основном у тканинах легенів (Goulaetal., 1998). З Іншого боку, описано Чима віпадків ефективного переносу плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ при локальному введенні препарату (Goulaetal., 1998). Рівень експресії введених у Клітини ссавців генів Залежить від багатьох чінніків, у тому чіслі и від сили елементів регуляції транскріпції трансгени. У випадка необхідності забезпечення високого уровня експресії трансгена перспективним вважається его размещения у векторі під контролем сильних промоторів.

Таким чином, актуальним є Вивчення експресії гена АРОА1 людини in vitro та in vivo при введенні рекомбінантної плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ, а такоже встановлення впліву на рівень експресії гена АРОА1 людини сильних гібрідніх промоторів.

Зв'язок роботи з Наукова програмами, планами, темами. Робота виконан в рамках плану фундаментальних ДОСЛІДЖЕНЬ відділу регуляторних механізмів Клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.3. "Вивчення на модельних об'єктах очікуваніх терапевтичних ефектів, обумовлених введенням рекомбінантніх молекул" (№ державної реєстрації 0103V000075, 2003-2007 pp.).

Мета та завдання дослідження: Метою даної роботи є дослідження експресії клітінамі СНО-К1 гена АРОА1 людини, Який знаходиться у складі рекомбінантніх плазмід під регуляцією різніх сильних промоторів, Вивчення експресії, трівалості знаходження та локалізації трансгена АРОА1 людини в організмі піддослідніх тварин.

Для Досягнення цієї мети поставлено Такі завдання:

1. создать рекомбінантні плазміді, Які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру / промотору середньораннього гена цітомегаловірусу людини з інтроном А цього ж гена (hCMV-ІA) та енхансеру середньораннього гена цітомегаловірусу людини, промотор та первого інтрону гена β-актину курчати (CAG) , для експресії в клітінах ссавців in vitro та in vivo.

2. здобудуть трансфіковані Клітини культури клітін яєчніків китайського Хом'яка (СНО-К1) при вікорістанні невірусного методу доставки цільової плазмідної ДНК.

3. Дослідіті експресію гена АРОА1 людини трансфікованімі клітінамі СНО-К1, одержаний для різніх рекомбінантніх плазмід.

4. Розробити експериментальну модель для дослідження експресії трансгена АРОА1 людини in vivo.

5. Дослідіті експресію гена АРОА1 людини, локалізацію та длительность его знаходження в організмі піддослідніх тварин при вікорістанні невірусного методу доставки цільової ДНК.

Об'єктом дослідження є експресія трансгена АРОА1 людини in vitro та in vivo, локалізація та длительность знаходження трансгена в організмі піддослідніх тварин.

Предметом дослідження є ген АРОА1 людини, что находится в рекомбінантніх плазмідах під контролем різніх елементів регуляції транскріпції.

Методи дослідження - мікробіологічні (нарощування и культівування бактерій, трансформація бактерій), генно-інженерні (полімеразна ланцюгова Реакція (ПЛР), зворотна транскрипція, віділення и рестрікційній аналіз плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантніх ДНК, гель-електрофорез ДНК), молекулярно-біологічні (експресія білків), імунохімічні (ферментний імуносорбентній аналіз (ELISA), Вестерн-блот аналіз), біохімічні (електрофорез білків), мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сконструйовано серію рекомбінантніх плазмід, Які містять повнорозмірній варіант гена АРОА1 людини під транскріпційнім контролем промоторів енхансеру / промотору середньораннього гена цітомегаловірусу людини (hCMV-ІЕ), hCMV-ІA та CAG. Вперше показано можлівість доставки рекомбінантніх плазмід Із геном АРОА1 людини у Клітини ссавців ін'єкцією комплексів плазмідна ДНК / ПЕІ у паренхіму печінкі. Вперше досліджено характер локалізації та длительность знаходження гена АРОА1 людини в організмі піддослідніх тварин при введенні плазмідної ДНК у складі комплексів з ПЕІ.

Практичне значення одержаних результатів. Здобуто стабільно трансфіковані клони культури клітін СНО-К1, что продукують білок АРОА1 людини. Оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини у плазмі крови трансфікованіх тварин. Результати дослідження могут буті вікорістані при розробці підходів до генно-терапевтічної корекції атеросклерозу, заснованої на вікорістанні невірусної системи доставки цільової ДНК.

Особистий внесок здобувача. Результати, вікладені у дисертації, ОТРИМАНО автором особисто або за безпосередньої участия у віконанні експеріментів. Зокрема, автором самостійно Створено рекомбінантні плазміді, оптимізовано умови детекції наявності гена АРОА1 людини в трансфікованіх клітінах ссавців, оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини in vitro та in vivo. Віділення та очищення плазмідної ДНК, віділення тотальної хромосомальної ДНК з клітін ссавців, ПЛР та імунохімічне дослідження експресії гена АРОА1 людини віконані безпосередно здобувачем. Робота із культівування культури клітін СНО-К1, одержаний транзиторно експресуючіх та стабільно трансфікованіх клітін СНО-К1, проводилися спільно з м.н.с. Т. А. Рубан та н.с. О. М. Сухорада. Розрахунок схем конструювання рекомбінантніх плазмід та розрахунок праймерів Було проведено спільно Із м.н.с. Д. М. Іродовім. Роботи, пов'язані Із піддосліднімі тварин проводили у співробітніцтві з Інститутом геронтології АМН України. Розробка програми вирішенню поставлених завдання, аналіз и Обговорення одержаних результатів ДОСЛІДЖЕНЬ проведені спільно з м.н.с. Д. М. Іродовім, д.мед.н. С. Н. Новіковою, м.н.с. О. К. Топорова, а такоже завідувачем відділу регуляторних механізмів Клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, д.б.н., професором, чл.-кор. НАН України, академіком АМН України В. А. Кордюм, з Якими автор має Спільні Публікації.

Автор вісловлює подяку науковому керівнику д.б.н., професору, чл.-кор. НАН України, академіку АМН України В. А. Кордюм за корисні поради та Критичні зауваження, а такоже всім співробітнікам, Які спріялі ее Виконання.

Апробація результатів дисертації. Результати ДОСЛІДЖЕНЬ доповідалісь на вітчізняніх та міжнародніх конференціях, сімпозіумах та з'їздах: XXX Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних ОРГАНІВ (Аахен, Німеччина, 2003), Конференції, прісвяченій 50-річчю Відкриття подвійної спіралі ДНК (Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, Україна, 2003), установчо з'їзді Українського товариства клітінної біології (Львів, Україна, 2004), XXXI Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних ОРГАНІВ (Варшава, Польща, 2004), Конференції моло дих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006» (Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна, 2006), ХІV Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства генної терапії (Афіни, Греція, 2006), а такоже на наукових семінарах відділу регуляторних механізмів Клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації Опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та тези 6 доповідей на конференціях.

Структура та ОБСЯГИ дисертації. Дисертація складається Із вступления, Огляду літератури, матеріалів та методів ДОСЛІДЖЕНЬ, результатів ДОСЛІДЖЕНЬ, Які представлені у 5-ти Розділах, АНАЛІЗУ та узагальнення результатів, списку використаних джерел (328 найменувань). Роботу виклади на 150 страницах машинописного тексту та проілюстровано 35 рисунками і 4 таблиці.

Основні ЗМІСТ

Матеріали и методи дослідження. В работе Використано штам Escherichia coli (E. Coli) DH10B, SureII. Дослідження проводили на культурах клітін СНО-К1 и заспівавши, щурах Лінії Вістар та кролях породи Шиншила.

Для конструювання векторів експресії вікорістовувалі плазміді pTRhCMV-IEapo (Топорова и співав., 2004), pBacMam-1 «Novagen» (США), pTR-GT60 (Кордюм и співав., 2003), pTRUFneo R- та pTRUF, Які були люб` язно надані С. Золотухінім (Gene Therapy Center Vector Core Lab, США), pBluSKM ( «Fermentas», Литва), pTR-EGFP (Кордюм и співав., 2004).

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (віділення плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному Гелі, елюцію фрагментів ДНК, гідроліз ДНК рестріктазамі, лігування ДНК, ПЛР) віконувалі согласно зі стандартними методами (Sambrook etal., 1989). Тотальна ДНК клітін віділялі с помощью набору реактівів «Genomic DNA Purification kit» ( «Fermentas»). У процедурах молекулярного клонування застосовувалі ферменти виробництва «Fermentas». Тотальна ДНК / РНК з клітін печінкі та крови тварин віділялі набором реактівів Рибо-золь А ( «Амплісенс», Російська Федерація). ДНК в пробах гідролізувалі с помощью дезоксирибонуклеази 1 ( «Sigma»). Синтез кДНК проводили з Використання набору реактівів «Реверта L-100» ( «Амплісенс»).

Трансфекцію клітін ссавців in vitro та in vivo здійснювалі с помощью розгалуженого ПEI (25 кДа, «Aldrich» (США)). Препарат ДНК / ПЕІ готувалі у масовому еквіваленті 1: 2, додаючі при перемішуванні розчин ПЕІ до Розчин плазмідної ДНК.

При трансфекції до 5 ∙ 10 5 клітін СНО-К1 вносили 5 мкг препарату плазмідної ДНК / ПЕІ. Відбір стабільно трансфікованіх клітін СНО-К1 проводили на середовіщі F10, что містіть 20% ембріональної телячої Сироватко та 1 мг / мл антібіотіка G418. Аналіз наявності Білка АРОА1 у культуральному середовіщі трансфікованіх клітін СНО-К1 здійснювалі методами ELISA, дот-блот та Вестерн-блот АНАЛІЗУ з Використання моноклональних Антитіл MGHLaa ( «ІМТЕК», Російська Федерація).

Препарат ДНК / ПЕІ вводили ін`єкцією в паренхіму печінкі піддослідніх тварин: по 100 мкг та 240 мкг ДНК на тваринне - щурам та кролям, відповідно. Введення препарату тваринам проводили при ультразвуковому дослідженні або при операции. Всі процедури проводили з Використання анестезуючіх препаратів, согласно загальнопрійнятіх міжнародніх правил поведение з тварин. Аналіз наявності АРОА1 людини в плазмі крови піддослідніх кролів здійснювалі Вестерн-блот аналізом Із Використання моноклональних Антитіл 3F10 ( «ICN», США). Кролям, Які утрімувалісь на холестеріновій дієті Щодня орально вводили 1,5% розчин холестерину у рослінній Олії з розрахунку 1 мг холестерину / кг ваги тварини. Визначення концентрації тотального холестерину у плазмі крови тварин проводили з Використання набору реактівів фірми «Sentinel Diagnostics» (Італія) та «Elitech Diagnostics» (Франція). Препарати тканин ОРГАНІВ кролів готувалі согласно загальнопрійнятіх методів (Лілі, 1969). Зрізі тканин забарвлювалі розчин гематоксіліну та еозіну за Ван-Гізоном.

Статистичний обробка результатів проводили за помощью програми Statistica 6.0.

Результати ДОСЛІДЖЕНЬ та Обговорення. Для корекції дефіціту Певного Білка в організмі та патенти підтрімуваті таку концентрацію цільового Білка, что відповідає его фізіологічній нормі або має терапевтичний ефект. При цьом для шкірного білкового продукту ця концентрація буде індівідуальною. Фізіологічна концентрація АРОА1 у плазмі крови людини ставити - 1,47 ± 0,17 мг / мл (Bekaertetal., 1993). Таким чином, для корекції атеросклерозу необхідне Досягнення високого уровня експресії трансгена АРОА1 людини.

Конструювання рекомбінантніх плазмід для експресії АРОА1 людини in vitro та in vivo. На сегодня Створено велику Кількість гібрідніх промоторів, Які ма ють вищу ШВИДКІСТЬ ініціації транскріпції порівняно з промотором hCMV-IE. Продемонструвати, что введене до складу вектора експресії Деяк геномних елементів, зокрема, інтронів та 3`- и 5`- послідовностей, Які НЕ транслюються, підвіщує рівень експресії трансгена як in vitro (Palmiteretal., 1991) так и в трансгенних тварин (Ebertetal. , 1998). Механізм впліву таких послідовностей на рівень експресії трансгенів не в усіх випадка відомій, но его пов`язують з такими явіщамі, як Підвищення частоти ініціації транскріпції, стабільності и ефектівності транспорту і / або Підвищення ефектівності формирование 3`-кінця мРНК при ее дозріванні (Kawamotoetal. , 1998). Тому, одним Із перспективних Шляхів Підвищення уровня експресії трансгена є использование послідовностей, що містять НЕ лишь промотор, а такоже и перший інтрон гена, транскріпцію которого регулює Сейчас промотор чи промотор Іншого гена, у випадка гібрідніх послідовностей. В експеримент Із Використання маркерні генів показано, что послідовності CAG та hCMV-ІA забезпечують вищий рівень синтезу трансгена in vitro порівняно з hCMV-IE (Niwaetal., 1991; Chapmanetal., 1991; Xiaetal., 2006). З Використання ціх промоторів здобуто трансгенні тварини (Okabeetal., 1997; Ishiietal., 1997) та Здійснено експресію трансгенів in vivo (Xuetal., 2001). ВРАХОВУЮЧИ дані літератури, использование ціх елементів регуляції транскріпції Видається перспективним для Підвищення уровня експресії трансгена АРОА1 людини в клітінах ссавців.

Як трансгени у работе Використано повнорозмірній геномний варіант гена АРОА1 людини (рис. 1).

Для ОЦІНКИ впліву віщезазначеніх гібрідніх послідовностей на експресію гена АРОА1 людини кроме віхідної плазміді pTRhCMV-IEapo, якові Створено співробітнікамі нашого відділу Ранее (Топорова и співав., 2004), Було сконструйовано рекомбінантні плазміді pTRC AG apo та pTRhCMV-I A apo. Для конструювання вектора експресії pTRC AG apo в плазміді pTRhCMV-IEapo промоторhCMV-IE Було замінено на CAG. Для здобуття цільової плазміді pTRhCMV-I A apo в плазміді pTRhCMV-IEapo промотор hCMV-IE Було замінено на hCMV-ІA.

Для Вивчення уровня експресії гена АРОА1 людини стабільно трансфікованімі клітінамі СНО-К1, до складу плазмід pTRhCMV-IEapo, pTRC AG apo та pTRhCMV-I A apo Було клоновано ген неоміцінфосфотрансферазі (neo R), Який дозволяє відбіраті Клітини на селективного середовіщі з антібіотіком G418 та ОТРИМАНО плазміді pTRhCMV-IEapo neo R, pTRC AG apo neo R, pTRhCMV-I A apo neo R.

Транзиторна експресія гена АРОА1 клітінамі СНО-К1. Нами Було досліджено експресію АРОА1 людини під контролем різніх елементів регуляції транскріпції транзиторно та стабільно трансфікованімі клітінамі СНО-К1.

Перевага использование транзиторної системи експресії є незалежність уровня експресії трансгена від «Ефект положення», тобто впліву регуляторних хромосомних елементів, оскількі експресія трансгена відбувається з неінтегрованіх послідовностей. Дослідження уровня транзиторної експресії трансгена трансфікованімі клітінамі СНО-К1 проводили после трансфекції клітін препаратами ДНК / ПЕІ з рекомбінантнімі плазмідамі: pTRhCMV-IEapo, pTRC AG apo та pTRhCMV-I A apo, що містять у своєму складі ген АРОА1 людини.

Наявність плазмідної ДНК у трансфікованіх клітінах визначавши на 6-ту добу после трансфекції с помощью методу «nested» ПЛР. Для проведення ПЛР вікорістовувалі розраховані нами с помощью програми Vector NTI Advance 10 парі праймерів Ap-r / Ap-f та Ap (n) -f / Ap (n) -r (ГІЛЬЧУК та співав., 2006).

Сінтезованій АРОА1 людини секретується клітінамі и тому его визначення проводили безпосередно у культуральному середовіщі. Для цього вікорістовувалі таку схему: через добу после трансфекції змінювалі середовище на безсіроваткове, на Наступний добу середовище Повністю відбіралі та зберігалі при -20 0 С, а до клітін додавали свіже середовище без Сироватко. Таким чином були відібрані Проби культурального середовища на 2-5 добу после проведення трансфекції клітін.

На 2-гу добу после трансфекції Вестерн-блот аналізом Було показано наявність АРОА1 людини в культуральному середовіщі клітін трансфікованіх рекомбінантнімі плазмідамі pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-I A apo (рис. 2).

Встановлен, что рівень синтезу АРОА1 клітінамі, трансфікованімі плазмідою pTRhCMV-I A apo, складає ~ 3 нг Білка / мл середовища за добу, в тій годину, як при трансфекції клітін плазмідою pTRhCMV-IEapo - ~ 0,4 нг / мл. Рівень експресії трансгена, что контролюється гібрідною послідовністю CAG, БУВ нижчих за чутлівість Використання методу АНАЛІЗУ (<0,2 нг / мл).

Експресія гена АРОА1 стабільно трансфікованімі клітінамі СНО-К1. Для порівняння сили промоторів, кроме транзиторної експресії трансгена у нізці віпадків досліджують експресію у пулі стабільно трансфікованіх клітін (Xiaetal., 2006). Це дозволяє Вилучити з АНАЛІЗУ Клітини, в Які при трансфекції НЕ попал цільовій ген. З Іншого боку, оскількі експресія трансгена відбувається з інтегрованіх векторних послідовностей ее рівень Залежить від "ЕФЕКТ положення". Для Зменшення впліву ЕФЕКТ положення трансгена на рівень его експресії, досліджується експресія пулом стабільно трансфікованіх клітін, а не окремий клонами.

Для дослідження синтезу АРОА1 людини у стабільно трансфікованіх клітінах Було проведено трансфекцію клітін СНО-К1 препаратами ДНК / ПЕІ з плазмідамі: pTRhCMV-IEapo neo R, pTRC AG apo neo R та pTRhCMV-I A apo neo R. Трансфіковані Клітини відбіралі на селективного середовіщі, Пожалуйста містіло антибіотик G418. После двох тіжнів селективного відбору клітін, Які були трансфіковані окремо шкірних з плазмід, ОТРИМАНО НЕ Менш чем 100 клонів стабільно трансфікованіх клітін.

Оскількі селекцію клітін после трансфекції проводили лишь за геном neo R, важліво Було Встановити наявність гена АРОА1 людини в трансфікованіх клітінах.Наявність трансгена визначавши в пулі трансфікованіх клітін ампліфікацією з різної кількості тотальної ДНК. При цьом визначавши мінімальну Кількість тотальної ДНК, продукт ампліфікації якої ще виявляв с помощью електрофорезу. Встановлен, что Різні кулі стабільно трансфікованіх клітін містять примерно однаково Кількість Копій АРОА1 людини на клітіну (рис. 3).

Для порівняння уровня експресії трансгена з різніх регуляторних елементів у пулах стабільно трансфікованіх клітін у чашки Петрі переносили по 1 · 10 6 клітін, отриманий для кожної з одержаних рекомбінантніх плазмід. Через добу середовище замінювалі на безсіроваткове, а через две доби відбіралі для АНАЛІЗУ. Аналіз проводили для пулів стабільно трансфікованіх клітін (надалі стабільно трансфіковані Клітини). Вміст АРОА1 у культуральному середовіщі визначавши методом ELISA (рис. 4).

Кількісній аналіз вмісту АРОА1 у культуральному середовіщі проводили такоже Вестерн-блот аналізом (рис. 5). Встановлен, что Рівні експресії гена АРОА1 людини клітінамі, трансформованості pTRhCMV-IEapo neo R, pTR CAG apo neo R та pTRhCMV-I A apo neo R, становили 156 нг / мл, 253 нг / мл та 634 нг / мл, відповідно. Одержані результати свідчать, что стабільно трансфіковані Клітини СНО-К1, Які були отрімані для плазмід pTR CAG apo neo R та pTRhCMV-I A apo neo R, забезпечують вірогідно вищий рівень синтезу трансгена, порівняно з рівнем отриманий для pTRhCMV-IEapo-neo R.

Аналіз трівалості знаходження трансгена АРОА1 людини in vivo. Важлівім етапом при розробці генно-терапевтичних підходів до корекції генетичних дефектів людини є проведення експеріментів на тварин для встановлення таких характеристик системи доставки трансгена, як спеціфічність, ефективність, Безпечність та інші.

Віходячі з результатів, одержаних на культурі СНО-К1, плазміда pTRhCMV-I A apo Забезпечує Найвищий рівень експресії гена АРОА1 людини порівняно з іншімі сконструйованімі нами плазмідамі. Однако, Із Даних літератури відомо, что характер експресії з промоторів может відрізнятісь для різніх тіпів клітін, та для ДОСЛІДЖЕНЬ in vitro та in vivo (Xuetal., 2001; Xuetal., 2002). Тому, Проводити вибір рекомбінантної плазміді для розробки підходу до ГТ атеросклерозу можливо лишь после ДОСЛІДЖЕНЬ in vivo. Кроме того, невідомо, Який рівень експресії цільового Білка можливо Забезпечити запропонованім нами методом генно-терапевтічної корекції дефіціту АРОА1 людини in vivo та чи достатній цею рівень для Отримання очікуваного терапевтичного ефектів. Тому Перші експеримент на тварин in vivo нами проводилися з метою дослідження як характеристик запропонованої нами системи доставки трансгена (длительность зберігання трансгена, его локалізація в організмі), так ідля Вивчення можливости уровня експресії гена АРОА1 людини в організмі кролів та здійснювався з Використання базової плазміді - pTRhCMV -IEapo.

Для дослідження трівалості знаходження трансгена АРОА1 людини, в організм піддослідніх тварин ін'єкцією в паренхіму печінкі вводили препарат плазміді pTRhCMV-IEapo. При цьом Кількість плазмідної ДНК, якові вводили тваринам (щур - 100 мкг, Кріль - 240 мкг), булу максимально можлива для цього методу, та обмежена сумарна об'ємом препарату, Який можливо ввести в паренхіму печінкі тварин без видимих ​​ее пошкоджень. Длительность зберігання трансгена в організмі аналізувалі за его наявністю у Фракції тотальної ДНК тканин печінкі через Різні проміжкі годині после Введення плазміді pTRhCMV-IEapo. Аналіз проводили методом «nested» ПЛР з використаних пар праймерів Ap-f / Ap-r, Ap (n) -f / Ap (n) -r та Ap (h-Rab) -f / Ap (h-Rab) -r , Ap (h-PigRab) -f / Ap (h-PigRab) -r), розрахованіх нами для Виявлення ДНК АРОА1 людини на фоні тотальної ДНК клітін щура та кроля, відповідно (ГІЛЬЧУК та співав., 2006).

Ген АРОА1 людини Виявлено в клітінах печінкі всех щурів піддослідної групи на 3-ю та 25-у добу после ін'єкції, у тій годину, як при подалі аналізі на 90-у добу, трансгени НЕ Виявлення в усіх проаналізованіх тварин (табл. 1 ). Одержаний результат может свідчіті про ті, что у зазначеним период часу после ін'єкції препарату ДНК / ПЕІ відбуваються процеси, что прізводять або до Зменшення у клітінах плазмідної ДНК до рівня, Який нижчих за чутлівість методу АНАЛІЗУ, або до загібелі трансфікованіх клітін. Варто Зазначити, что в усіх випадка трансгени виявляв лишь за результатом іншого раунду ампліфікації, однак при цьом спостерігалі гетерогенність проб за кількістю сінтезованого амплікону та за наявністю чи відсутністю продукту первого раунду ампліфікації.

Таблиця 1

Длительность знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітін печінкі щурів, определена методом «nested» ПЛР

Кількість тварин

Час, что пройшов післяін'єкції, доба
3 6 15 25 90
У ДНКякіх Виявлено цільовій ген 2 3 2 2 0
Загальна 2 4 3 2 3

Дослідження наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК клітін печінкі кролів виявило трівале Збереження цільової ДНК в клітінах (табл. 2). Так, трансгени виявляв и на 85-у добу после Введення ДНК, в тій годину, як на 150-у добу АРОА1 людініне детектувалі. Через годину после Введення плазмідної ДНК у паренхіму печінкі трансгени БУВ детектованій у Першому раунді «nested» ПЛР, в тій годину, як в усі следующие часові періоді его наявність детектувалі за продуктами іншого раунду ампліфікації. При цьом НЕ спостерігалі значної гетерогенності за кількістю продуктів ампліфікації, что можна значний мірою поясніті особлівістю АНАЛІЗУ наявності гена АРОА1 людини сортаменту з використаних пар праймерів Ap (h-Rab) -f / Ap (h-Rab) -r та Ap (h-PigRab ) -f / Ap (h-PigRab) -r: Було показано інгібування іншого раунду ПЛР з Використання прймерів Ap (h-PigRab) -f / Ap (h-PigRab) -r при більшій за 10 6 кількості Копій цільової ДНК у реакційній суміші.

Таблиця 2

Длительность знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітін печінкі кролів, определена методом «nested» ПЛР

Кількість тварин

Час, что пройшов после ін'єкції, доба
1/24 6 14 30 85 150
У ДНК якіх Виявлено цільовій ген 1 3 1 1 3 0
Загальна 1 3 1 1 3 2

Встановлення локалізації введеного трансгена in vivo. Дослідження розповсюдження плазмідної ДНК в органах піддослідніх тварин проводили на щурах та кролях, Яким ін'єкцією в паренхіму печінкі вводили препарат ДНК / ПЕІ. Тварин забивали на 6-у та 85-у добу после ін'єкції плазміді pTRhCMV-IEapo. Для проведення АНАЛІЗУ відбіралі у щурів Проби тканин печінкі, серця, легенів та нірок, а у кролів, окрім ціх ОРГАНІВ - такоже лімфатічні Вузли та стінку аорти.

С помощью підібраніх для кожної з тварин наборів праймерів проведено «nested» ПЛР аналіз наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК, что булу віділена з тканин різніх ОРГАНІВ щурів та кролів. За результатами іншого раунду «nested» ПЛР встановлен наявність трансгена в усіх проаналізованіх зразки тканин тварин (табл. 3) (чутлівість «nested» ПЛР у прісутності ДНК щура 10 Копій гена АРОА1 людини / 500 нг ДНК, у прісутності ДНК кроля - 10 3 Копій гена / 500 нг ДНК). Це свідчіть про ефективність доставки плазмідної ДНК ін'єкцією in vivo у складі комплексів ПЕІ / ДНК.

Таблиця 3

ПЛР аналіз розповсюдження в організмі піддослідніх тварин гена АРОА1 после Введення плазмідної ДНК

тварини

Час после вступі, доба органи
печінка Легені серце нирки Лімфовузлі

Стінка

аорти

Щур (n = 3) 6 + + + + н / п н / п
Кролик (n = 3) 6 + + + + + +
Кролик (n = 3) 85 + + + + + +

Примітки: + трансгени Виявлено; -трансген не виявлено; н / п - дослідження не проводили.

Результати АНАЛІЗУ локалізації трансгена in vivo показали, что частина плазмідної ДНК, якові Було введено в печінку, потрапляє з міжклітінною рідіною та лімфою, або через капілярі з венозної кров'ю, у Кровообіг, и таким чином, розповсюджується по організму. Альо в даного випадка, методом ПЛР, Важко візначіті, чи потрапляє плазмідна ДНК у Клітини тканин других ОРГАНІВ (серце, легені, нирки, лімфовузлі), чи віявляється лишь плазмідна ДНК, яка знаходиться у крови в капілярах ціх ОРГАНІВ або у клітінах ендотелію Судін. Звичайно, при локальному введенні плазмідної ДНК з катіоннімі ліпідамі спостерігають зберігання переважної кількості трансгени біля місця введення (Eliyahuetal., 2007), что з скроню вірогідністю вірно и для комплексів ДНК / ПЕІ. Однако, використаних нами для АНАЛІЗУ локалізації трансгена метод «nested» ПЛР, З метою підвищення чутлівості АНАЛІЗУ, що не дозволяє делать Висновок относительно кількісного розподілу введеної плазміді та відображає лишь якісно здатність трансгени потрапляті до питань комерційної торгівлі тканин організму после Введення плазміді запропонованім нами методом.

Дослідження синтезу АРОА1 та очікуваного терапевтичного ефектів при повторному введенні плазміді pTRhCMV-IEapo тваринам. Вивчення ефектів, обумовлених введенням трансгена АРОА1 людини in vivo здійснювалі на експеріментальній моделі атеросклерозу, якові одержувалі при утрімуванні кролів на холестеріновій дієті. Відомо, что метаболізм ліпопротеїдів кролів більш подібний до метаболізму людини порівняно з метаболізмом мишей та щурів (Moghadsianetal., 2001). Саме тому кролі з експериментально індукованім атеросклерозом є адекватною моделлю для Вивчення ефектів від Введення трансгена людини на метаболізм ліпопротеїдів та спрійнятлівості до атеросклерозу. При утріманні кролів на холестеріновій дієті Вже на другий тиждень спостерігається зростання вмісту холестерину у крови піддослідніх тварин и надалі таке зростання продовжується щонайменш 4 місяці (Цінціадзе і співавт., 1981). Це виробляти до гістологічніх та морфологічніх змін тканин ОРГАНІВ, зокрема: печінкі, легенів, нірок, серця, стінок Судін та других. Віходячі з віщезазначеного, у даній работе аналізувалі Вплив введенні у складі комплексів з ПЕІ трансгена АРОА1 людініна вміст тотального холестерину у плазмі крови, морфологію тканин печінкі, серця та стінкі аорти у кролів з експериментально індукованім атерослерозом.

Досліди проводили на кролях, Які були поділенні на две групи: тваринам Першої групи (n = 4) Тричі вводили плазміду pTRhCMV-IEapo, дотрімуючісь проміжку один місяць между ін'єкціямі; второй, контрольній, групі (n = 4) вводили плазміду pTR, что НЕ містіть цільовій ген за такою ж схемою. После первого Введення плазмідної ДНК всех кролів утрімувалі на холестеріновій дієті. На шосту добу после шкірного введення препарату плазмідної ДНК у тварин відбіралі кров для АНАЛІЗУ наявності АРОА1 людини. Одночасно визначавши концентрацію тотального холестерину у плазмі крови тварин.

Для імунохімічного визначення вмісту АРОА1 людини у плазмі крови піддослідніх кролів досліджувалі спеціфічність КОМЕРЦІЙНИХ моноклональних та поліклональніх Антитіл проти АРОА1 людини та оптімізувалі метод Вестерн-блот АНАЛІЗУ.

З Використання методу Вестерн-блот АНАЛІЗУ на шосту добу после Першої ін'єкції препарату ДНК / ПЕІ в плазмі крови трьох тварин Першої групи Було Виявлено АРОА1 людини, в тій годину, як у плазмі тварин контрольної групи ВІН НЕ візначався (рис. 6). Порівняння рівнів експресії трансгена показало, что концентрація АРОА1 людини в плазмі крови відрізнялась від тварини до тварини и становила від ~ 1,6 мкг / мл до ~ 20,2 мкг / мл.

Аналіз зростання уровня тотального холестерину у плазмі крови тварин виявило достовірні розбіжності между контрольних та піддослідною групами тварин (табл. 4, рис. 7).

Таблиця 4

Зростання уровня холестерину у кролів, Яким вводили плазміді,%

тварини

відбір Проби
До введення плазмід После 1 введення После 2 введення После 3 введення При забої тварин
Із введенням плазмідою pTRhCMV - IEapo 100 147 112 357 597
100 299 331 192 235
100 190 130 100 751
100 115 82 262 276

Із введенням плазмідою pTR

100 498 511 678 729
100 400 413 451 617
100 193 209 312 369
100 398 450 859 703

Попередні результати морфологічного дослідження тканин кролів контрольної групи виявило потовщення інтімі у ділянці дуги аорти, а у тканинах печінкі - інфільтрацію ліпідамі різного ступенів в центральних та періферійніх зонах органу. У тій же година аналіз тканин кролів, Яким водили плазміду pTRhCMV-IEapo, що не виявило атеросклеротичних змін аорти та печінкі тварин (рис. 8).

ВИСНОВКИ

У результате Виконання дісертаційної роботи досліджено експресію трансгена АРОА1 людини, розміщеного у векторах експресії під регуляцією різніх промоторів, у клітінах ссавців in vitro; Вівче длительность Збереження, локалізацію та експресію трансгена in vivo, что БУВ введень ін'єкцією у паренхіму печінкі тварин у складі комплексу плазміді pTRhCMV - IEapo з ПЕІ.

1. Вперше сконструйовано серію рекомбінантніх плазмід, Які містять повнорозмірній варіант гена АРОА1 людини під транскріпційнім контролем промоторів hCMV-ІA та CAG: pTRhCMV - IAapo, pTRCAGapo, Які, здатні Забезпечити високий рівень експресії трансгена в клітінах ссавців.

2. У транзіторній системе експресії для трансфікованіх плазмідамі pTRhCMV - IEapo та pTRhCMV - IAapo клітін СНО-К1 показано синтез АРОА1 людини на Рівні ~ 0,4 нг / мл и ~ 3 нг Білка / мл середовища, відповідно.

3. На культурах стабільніх трансформантів СНО-К1 підтверджено, что гібрідні промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з промотором hCMV-ІЕ.

4. Експериментально показано можлівість Підвищення уровня експресії трансгенів, Які є повнорозмірнімі геномної варіантамі, введенням до складу елементів регуляції транскріпції послідовності інтрону.

5. продемонструвати, что трансгени, введень в організм піддослідніх тварин ін'єкцією у паренхіму печінкі у складі комплексів плазміді з розгалуженім поліетіленіміном, может потрапляті кроме печінкі до тканин других ОРГАНІВ, зокрема: легенів, серця, нірок, лімфовузлів та клітін стінкі аорти.

6. встановлен Збереження трансгени у клітінах печінкі щурів та кролів щонайменш 25 діб та 85 діб у разі Введення цільової ДНК ін'єкцією у паренхіму печінкі у комплексі з поліетіленіміном.

7. На 6-ту добу после трансфекції плазмідою pTRhCMV - IEapo показано Накопичення АРОА1 людини на Рівні 1,6-20 мкг / мл у плазмі крови кролів.


ПЕРЕЛІК наукових праць, ОПУБЛІКОВАНІХ за темою дисертації

1. ГІЛЬЧУК Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Вивчення транзиторної експресії гена АРОА1 людини під регуляцією різніх гібрідніх послідовностей в клітінах СНО-К1 // Біополімери и клітина. - 2006. - Т. 22, № 3. - С. 210-217. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантніх плазмід; визначення уровня синтезу АРОА1 людини клітінамі СНО-К1, трансфікованімі препаратами ДНК / ПЕІ; ПЛР аналіз трансгени.

2. ГІЛЬЧУК Ю. М., Іродов Д. М., Старокадомській П. Л., Пішель І. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Розповсюдження по органах та експресія гена АРОА1 людини у складі введеної плазмідної ДНК in vivo // Біополімери и клітина. - 2006. - Т. 22, № 6. - С. 439 - 445. Особистий внесок здобувача - оптимізація умов проведення ПЛР АНАЛІЗУ гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованіх клітін кролів та свиней; віділення РНК Із зразків печінкі кролів; ПЛР аналіз ДНК тканин піддослідніх тварин; тестування спеціфічності зв'язування моноклональних та поліклональніх Антитіл до АРОА1 людини у плазмі крови різніх тварин методом Вестерн-блот АНАЛІЗУ; детекція АРОА1 людини в плазмі крови піддослідніх кролів.

3. ГІЛЬЧУК Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Експресія гена аполіпопротеїна А-1 людини під контролем різніх регуляторних послідовностей стабільнімі трансформанта СНО-К1 // Доповіді академии наук України. - 2007. - Т. 23, № 4. - С. 169-172.Особістій ​​внесок здобувача - конструювання рекомбінантніх плазмід; дослідження методами ELISA та Вестерн-блот АНАЛІЗУ культурально середовище клітін СНО-К1, трансфікованіх препаратом ДНК / ПЕІ; проведення ПЛР АНАЛІЗУ ДНК тварин.

4. ГІЛЬЧУК Ю. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Вплив Введення трансгена аполіпопротеїну А-1 людини на рівень холестерину та морфологію тканин у кролів, Які утрімуваліся на холестеріновій дієті // Біополімери и клітина. - 2008. - Т. 24, № 1. - С. 78-81.Особістій ​​внесок здобувача - Приготування препарату плазмідна ДНК / ПЕІ.

5. Kordyum V., Toporova O., Novikova S., Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Lihachova L., Morgunov P., Irodov D. In vivo gene transfer of human APOA1 genomic DNA results in markedly high transient expression in model animal // XXX Annual ESAO Congress, Abstract book. - Aachen (Germany), 2003. - P. 664. Особистий внесок здобувача - тестування спеціфічності зв'язування моноклональних та поліклональніх Антитіл до АРОА1 людини методом Вестерн-блот АНАЛІЗУ; визначення наявності АРОА1 людини в плазмі крови піддослідніх кролів.

6. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Suchorada H., Toporova O., Irodov D. Expression of human APOA1 gene in mammalian cells in vitro // Conference for students, PhD students and young scientists, Abstract book. - Kiyv (Ukraine), 2003. - P. 168.Особістій ​​внесок здобувача - визначення методом ELISAрівня синтезу АРОА1 людини трансфікованімі клітінамі СНО-К1.

7. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S., Kordyum V. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR -analysis // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Abstract book. - Lviv (Ukraine), 2004. - P. 226.Особістій внесок здобувача - оптимізація умов ПЛР АНАЛІЗУ гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованіх клітін щурів; віділення ДНК Із зразків тканин різніх ОРГАНІВ піддослідніх тварин; ПЛР аналіз тотальної ДНК тканин різніх ОРГАНІВ піддослідніх щурів.

8. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR -analysis // XXXI Annual ESAO Congress "Towards medicaltechnology of the future", Int. J. Artif. Organs. - 2004. -Vol. 27, № 7. - Р. 591. Особистий внесок здобувача - віділення ДНК Із зразків тканин різніх ОРГАНІВ піддослідніх тварин; ПЛР аналіз ДНК тканин різніх ОРГАНІВ піддослідніх щурів.

9. ГІЛЬЧУК Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К. Вивчення експресії гена Ароа-1 людини під регуляцією різніх гібрідніх послідовностей в СНО-К1 // Матеріали конференции-конкурсу робіт молодих учених, прісвяченої 100-річчю від Дня народження В. О. Бєліцера "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006". - C. 7. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантніх плазмід; тестування характеристик зв'язування моноклональних та поліклональніх Антитіл до АРОА1 людини методами ELISA та Вестерн-блот АНАЛІЗУ; дослідження культурально середовище клітін СНО-К1, трансфікованіх препаратом ДНК / ПЕІ.

10. Novikova S., Toporova O., Gilchuk Iu., Kordyum V. Non-viral gene delivery of human APOA1 into mammalian cells in vitro and in vivo // XIV Annual Congress of the European Society of Gene Therapy , Abstract book. - Athens (Greece), 2006. - Р. 157.Особістій ​​внесок здобувача - ПЛР аналіз ДНК трансфікованіх клітін; Виявлення АРОА1 людини в плазмі крови піддослідніх кролів та культуральному середовіщі трансфікованіх клітін.


Анотація

ГІЛЬЧУК Ю. М. ЕФЕКТ, обумовлені введенням у Клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступенів кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Дісертацію присвячено дослідженню ефектів, обумовлених введенням плазмідної ДНК з геном АРОА1 людини, на культурі клітін та тварин. У результате роботи сконструйовано серію рекомбінантніх плазмід, Які містять геномний варіант гена АРОА1 людини під регуляцією промоторів hCMV-ІЕ, hCMV-ІA та CAG. При дослідженні пулів стабільно трансфікованіх клітін СНО-К1 показано, что промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з hCMV-ІЕ. Виявлено, что трансгени, введень в організм піддослідніх тварин ін'єкцією у паренхіму печінкі у складі комплексів плазміді з поліетіленіміном (ПЕІ), потрапляє кроме печінкі до других ОРГАНІВ. А також, зберігається у клітінах печінкі щурів та кролів щонайменш 25 діб та 85 діб, відповідно. Встановлен, что Введення гена АРОА1 людини під контролем hCMV-ІЕ, у складі комплексів з ПЕІ у печінку кролів, виробляти до Накопичення АРОА1 людини у крови тварин та зниженя уровня атеросклеротичного пошкодження тканин досліджуваніх ОРГАНІВ и вмісту тотального холестерину у крови порівняно з контрольною групою кролів при утрімані тварин на холестеріновій дієті.

Ключові слова: аполіпопротеїн А-1, поліетіленімін, трансгени, експресія.


АНОТАЦІЯ

Гильчук Ю. Н. Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 особа. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена дослідженню ефектів, обумовлених введенням плазмідної ДНК з геном АРОА1 людини, на культурі клітин і тварин. В результаті роботи сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, содержащіхгеномний варіант гена АРОА1 людини під регуляцією промоторів hCMV-ІЕ, hCMV-ІA і CAG.При дослідженні пулів стабільно трансфікованих клітин СНО-К1 показано, що промотори hCMV-ІA і CAG забезпечують більш високий рівень експресії АРОА1 людини в порівнянні з hCMV-ІЕ. Продемонстровано, що трансгени, введений в організм тварин ін'єкцією в паренхіму печінки в складі комплексів плазміди з поліетиленом, потрапляє крім печінки в інші органи. А такжесохраняется в клітинах печінки щурів і кролів найменше 25 і 85 діб, відповідно. Встановлено, що введення гена АРОА1 людини під контролем hCMV-ІЕ, в складі комплексів плазмида / ПЕІ в печінку кролів, призводить до накопичення АРОА1 людини в крові тварин існіжает рівні атеросклеротичного ушкодження досліджуваних органів і змісту тотального холестерину в крові тварин в порівнянні з контрольною групою кроликів при утриманні кролів на холестеринової дієті.

Ключові слова: аполіпопротеїн А-1, поліетиленімін, трансгени, експресія.

SUMMARY

Gilchuk Iu. M. The effects caused by injection of human apolipoprotein A -1 transgene into mammalian cells. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.22 - molecular genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The elaboration of methods of genes delivery into somatic cells is the foundation of gene therapy development. There is necessity to develop new and more effective vectors as well as corresponding methods of gene delivery into target tissues. The plasmid vectors, which may be applied at cells transfection by physical or chemical methods , do not have disadvantages, inherent to virus vectors, though they are characterized by much lower effectiveness of transfection in vivo in comparison with the latter at their usage for genes transfection in vivo. The analysis of distribution of plasmid molecules in tissues and transgene expression are constituent parts of valuation of effectiveness of gene therapy methods for a target gene delivery. To correct disorder, caused by the deficiency of expression of a specific gene in the organism, high level of expression of a target transgene is often necessary to achieve physiological concentrations of the protein and therapeutic effect correspondingly. It was shown that the expression level of genes, introduced into mammalian cells, depends on many reasons, including the strength of transcription regulatory elements. One of the perspective strategies of solving the problem, connected with a low level of transgenes expression, is optimization of already known regulatory sequences and search for stronger ones. To some degree it might solve the problem of low effectiveness of cells transfection by the plasmid vectors.

The goal of this work was the construction of plasmid vectors , containing genome variant of human apolipoprotein A-1 (APOA1) gene under the transcriptional control of different elements, as well as the study of transient expression of human APOA1 gene in CHO -K1 cells , the examination of the transportation and the distribution of human APOA1 containing plasmid DNA , as a part of complexes of DNA / polyethyleneimine (PEI) in rats and rabbits, the investigation of the time course clearance of target gene and human APOA1 expression in vivo .

The recombinant plasmids containing the genomic human APOA1 gene under the transcriptional control of promoters , namely, the cytomegalovirus immediate early enhancer / chicken β-actin promoter and first intron (CAG promoter) and cytomegalovirus immediate early enhancer / promoter with intron A (hCMV-IA promoter) have been constructed. The transient expression of human APOA1 gene has been studied in CHO -K1 cells using designed and pTRhCMV-IEapo (cytomegalovirus immediate early enhancer / promoter (hCMV-EI)) vectors. The expression of the transgene for transfected with pTRhCMV -IEapo and pTRhCMV-IAapo CHO-K1 cells have been shown. The expression of human APOA1 on the level of ~ 0,4 and ~ 3 ng of protein per 1 ml of the medium was shown for CHO-K1 cells, transfected correspondingly by pTRhCMV-IEapo and pTRhCMV-IAapo plasmids on the 2 nd day after the transfection.

The recombinant plasmids (pTRhCMV-IEapo-neo R, pTRhCMV-IAapo neo R and pTRCAGapo neo R), containing neomycinphosphotransferase gene (neo R), have been constructed for obtaining stable transformants. The expression of human APOA1 gene for all pools of stable transformants has been detected . The higher level of expression of the transgene for pools obtained by transfection with pTRhCMV -IAapo neo R and pTRCAGapo neo R than with pTRhCMV -IEapo-neo R has been shown.

The study of the transfer of the plasmid DNA , containing human APOА1 gene, in complex with PEI into rat and rabbit liver parenchyma and time period of transgene clearance in vivo has been performed . The presence of human APOA1 gene was revealed in genetic material , in all organs of experimental animals, the tissues of which had to be analyzed (liver, heart, lungs, kidneys, aorta and lymph nodes). The result obtained may testify in favour of indirect DNA transfer and may be explained by the fact that the part of liver-introduced plasmid DNA gets into the blood stream with intercellular liquid and lymph or with venous blood through capillaries, and is spread in organism. The presence of human APOA1 gene was discovered over the time of 25 th and 85 th days after plasmid injection in total DNA of liver cells rat and rabbit , accordingly.

There are two issues that make the APOA1 human protein analysis more difficult, namely, blood containing animal AроA1 in rather high concentration and molecular weight of APOA1, which does not differ essentially for different species. The selection of system of reagents for immune-chemical detection of human APOA1 protein in blood plasma of rabbits using both ELISA and Western-blot was the part of our work. Therefore, we have optimized the Western-blot method of detection for human APOA1 in blood of rabbits.

Investigating the synthesis of human APOA1 in vivo the rabbits under investigation were divided into two groups . The first group of rabbits was introduced repetitive injection of human APOA1 gene as a part of pTRhCMV -IEapo vector, the second group (control) - repetitive injection of pTR plasmid containing no target gene . All rabbits have been fed a cholesterol-rich diet from day of plasmid injection. On the 6th day after injection, human APOA1 protein in blood plasma of first group of rabbits was detected using the Western-blot method, while in blood plasma of the second group of rabbits it was not detected (sensitivity of Western-blot method was ~ 1 μg of human protein / ml of rabbit blood plasma). Having performed quantitative assessment of transgene expression, the concentration of human APOA1 in blood plasma was 1,6-20,2 μg / ml from rabbit to rabbit. It has been shown that repetitive injection of plasmid DNA , containing human APOA1 gene, in the complex with PEI into the liver parenchyma of cholesterol -rich diet rabbits influenced cholesterol concentration in animal blood and morphology of tissues . Thus, APOA1 injected animals were shown not to reveal the increase in total cholesterol concentration in blood and morphology alteration of liver and vessel tissues , specific for atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits.

Key words: apolipoprotein A-1, polyethylenimine, transgene, expression.



Скачати 55.56 Kb.