Дослідження антівірусної актівності 6-азацітідіну та амізону в модельній системе: цітомегаловірус - культура клітін фібробластів легень ембріона людини






    Головна сторінка





Дата конвертації29.11.2017
Розмір52.6 Kb.
Типреферат

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АБДУЛЛАЄВА МАЙЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 578.825.12: 578.74 [058.86 + 078.33]: 615.281

ДОСЛІДЖЕННЯ АНТІВІРУСНОЇ АКТІВНОСТІ 6-АЗАЦІТІДІНУ ТА амізону В МОДЕЛЬНІЙ Системі: ЦІТОМЕГАЛОВІРУС - КУЛЬТУРА КЛІТІН ФІБРОБЛАСТІВ легень ЕМБРІОНА ЛЮДИНИ

03.00.06 - Вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступенів

кандидата біологічних наук

Київ - 2008


Дісертацією є рукопис

Робота виконан в Інстітуті епідеміології та інфекційніх хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України

Науковий керівник: доктор медичний наук, професор, член-кореспондент НАН та АМН України, РАМН, заслужений діяч науки и техніки України Фролов Аркадій Федорович

Інституту епідеміології та інфекційніх хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач відділу Загальної вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна Інститут урології АМН України, завідувач лабораторії мікробіології, вірусології та мікології кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Нестерова Надія Віталівна Інститут мікробіології и вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії РЕПРОДУКЦІЇ вірусів

Захист дисертації відбудеться "4" березня 2008 р. про 14 рік. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, Аудиторія 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.

З дісертацією можна ознайомітісь у Бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: Україна, 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланій "28" січня 2008 р.

вчений секретар

спеціалізовано вченої ради О.В. Молчанець


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цітомегаловірусна інфекція (ЦМВІ) на сегодня особливо актуальна проблема сучасності. За оцінюючімі данімі, рівень інфікування цітомегаловірусом, як у cвіті так и у Нашій стране ставити более 90% (Trincado DE, 2000; Нісевіч Л.Л., 2002 та інш.).

Особливо важліве місце ЦМВІ Належить у патології плоду, новонароджених и дітей раннього віку. Вона є однією Із причин самовільніх вікіднів, передранніх пологів, вроджених вад розвитку, фетопатій. Небезпечна ЦМВІ є и для реціпієнтів ОРГАНІВ та кісткового мозком, онкологічніх Хворов та ВІЛ-інфікованих (Чешік С.Г., 2001).

Широкий спектр клінічніх проявів та розповсюдженість ЦМВ среди усіх верств населення, спонукає звернути Рамус на своєчасну діагностику ЦМВІ, ВРАХОВУЮЧИ якові, можливо у найкоротшій срок скоректуваті стратегію лікування для хвороби. Найбільш розповсюджені методи Виявлення ЦМВ імуноферментній та полімеразної ланцюгової Реакції ма ють ряд недоліків, Із якіх найбільш Значний Полягає у складності діференційної діагностики первинної, персістентної чи реактівованої інфекції. Це обгрунтовує использование у мировой лабораторній практике Нових методів ранньої спеціфічної експрес діагностики ЦМВІ.

Хіміотерапія ЦМВІ є складним и в багатьох випадка НЕ ​​вірішенім завдання. Існуючі хіміотерапевтічні засоби поки НЕ дозволяють досягті повної зупинки продуктівної реплікації ЦМВ. Основні препарати, Які спеціфічно інгібують репродукцію ЦМВ (ганцікловір, валганцікловір, фоскарнет и цідофовір) ма ють побічні токсичні ЕФЕКТ (Дзюблик І.В, 1999; DeSmet MD, 1999). А трівале! Застосування ганцікловіру у великих дозах віклікає формирование резістентності до ЦМВ (Mendez JC, 1999). Кроме того, довготрівалі курси лікування до цього часу залішаються Надзвичайно дорогими при сумнівному ефекті.

Саме тому актуальним харчування дослідження ефектівності методів лабораторної діагностики ЦМВІ, Які дозволяють Встановити форму інфекції та поиска Нових анти-ЦМВ ЗАСОБІВ Із Вивчення механізмів їх Дії и Було присвячено Дану дісертаційну роботу. Даній напрямок ДОСЛІДЖЕНЬ дасть можлівість вдосконаліті методи діагностики та лікування ЦМВІ.

Зв'язок роботи з Наукова програмами, планами, темамі.Роботу виконан у відповідності з безпосередньо наукових досліджень Інституту епідеміології та інфекційніх хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, лабораторії Загальної вірусології, у рамках тематичного плану "Вивчення механізмів епідемічного процесса при гріпі та цітомегаловірусній інфекції", завдання: "Цітогенетічні дослідження гострої та персістентної форми ЦМВ-інфекції", та "Вивчення механізмів Дії амізону та 6-аzaC на репродукцію ЦМВ in vitro "у 2001-2004 роках (шифр: 084, номер держреєстрації 01.02.U 000631).

Мета и задачі дослідження. Мета роботи - дослідження діагностичної цінності методів ранньої лабораторної діагностики ЦМВІ, а такоже Вивчення анти-цитомегаловірусної актівності 6-аzaC та амізону.

Для Досягнення поставленої в работе мети передбачало вирішенню Наступний завдань:

1. Встановити ефективність Виявлення ранніх білків ЦМВ Швидко культуральним методом та у тесті на Виявлення антігенемії;

2. Дослідіті можлівість діференціації персістентної та гострої форм ЦМВІ с помощью експресності методів лабораторної діагностики (ШКМ, ІФА, ПЛР, ТАГ);

3. Вівчіті Цитотоксичність дію 6-azaC та амізону в культурі клітін фібробластів легень ембріона людини;

4. Дослідіті анти-ЦМВ Активність 6-azaC та амізону у дослідах in vitro;

5. Візначіті Вплив 6-azaC та амізону на синтез ранніх (Р72, рр65) та пізніх (gB) вірусніх білків в інфікованих клітінах.

Об'єкти дослідження - цітомегаловірус людини АD 169, лейкоцити та Сироватко періферічної крови пацієнтів, Антивірусні препарати, інфіковані та неінфіковані ЦМВ Клітини культури ФЛЕЛ, моноклональні антитіла направлені до р 72, рр 65, gB білків ЦМВ.

Предмет дослідження - імунні комплекси антиген-антітіло, репродукція ЦМВ, цітотоксічність та анти-ЦМВ Активність 6-azaC та амізону.

Методи дослідження - для Виконання поставлених завдання вікорістовувалі вірусологічні, молекулярно-біологічні та імунологічні методи, а такоже методи статистичної ОБРОБКИ результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано скроню діагностічну Цінність Швидкого культурального методу, Який підтверджує у 65% новонароджених и дітей раннього віку и у 70% Хворов после трансплантації нирки - Гостра форму ЦМВІ. Показано, что с помощью тесту на Виявлення антігенемії за 3-4 рік. можливо віявіті Ранні Білки вірусу и Встановити форму перебігу ЦМВІ. Вперше встановлен анти-ЦМВ Активність 6-аzaC та амізону in vitro, что дает змогу розглядаті їх, як перспектівні проти-ЦМВ агенти. Доведено, что Механізм Дії ціх ЗАСОБІВ Полягає в інгібіції ситезу пізнього структурного білку gB.

Практичне значення одержаних результатів. Отрімані дані експериментально доводять скроню ефективність! Застосування Швидкого культурального методу та тесту на Виявлення антігенемії, что дозволяє віддіференціюваті Гостра и персистентного форми ЦМВІ. За результатами ДОСЛІДЖЕНЬ Було Створено проект: "Модифікація и! Застосування Швидкого культурального методу, як новой технології діагностики цитомегаловірусної інфекції" за №76 / 4 від 29.10.04 р. у напрямі: "Діагностика и методи лікування найпошіренішіх захворювань". Результати могут буті вікорістані в розробці методичних рекомендацій по діагностіці ЦМВІ у новонароджених та дітей раннього віку, а такоже у Хворов после трансплантації ОРГАНІВ чи тканин. Виявлено и підтверджена в дослідах анти-ЦМВ Активність 6-azaC и амізону обґрунтовує необходимость Наступний етапів ОЦІНКИ препаратів, Які могут буті вікорістані для клінічного Впровадження, як Нові проти-ЦМВ засоби. Результати Даних ДОСЛІДЖЕНЬ відображені в деклараційніх патентах: на Винахід - №69986 А "Інгібітор цітомегаловірусу людини 2-bD- рібофуранозіл -5- аміно-1,2,4 - триазин -3 (2Н) - ОН", на корисностей модель - №10889 "Застосування 4- (N-бензил) амінокарбонілу -1-метілпірідінію йодиду як профілактічного інгібітора цитомегаловірусної інфекції людини".

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізована наукова література по темі дисертації. Основний об'єм експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманий результатів, формулювання вісновків дісертаційної роботи Виконаю пошукачем особисто. Здобувачем самостійно проаналізовано одержаний експериментальний матеріал, Який викладеня автором у ряді статей у фахових виданнях та тезах доповідей на вітчізняніх та міжнародніх конференціях. Планування основних напрямків ДОСЛІДЖЕНЬ дісертаційної роботи, Обговорення отриманий результатів та їх узагальнення здійснені під керівніцтвом д.мед.н, професора, чл.-кор. НАН та АМН України, РАМН, заслуженого діяча науки и техніки України Фролова Аркадія Федоровича.

При проведенні Даних ДОСЛІДЖЕНЬ автор вікорістовувала моноклональні антитіла до білків ЦМВ, Які були отрімані Ранее у відділі клітінної інженерії Науково дослідного інституту вірусології РАМН, с.н.с., к.б.н. Макарова Н.Е ..

Значний часть ДОСЛІДЖЕНЬ виконан на базі лабораторії клітінної інженерії Науково дослідного інституту вірусології РАМН, Москва (д.б.н., проф. Кущ А.А., к.б.н. Федорова Н.Е.), лабораторії контролю якості імунобіологічніх препаратів Інституту епідеміології та інфекційніх хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (д.мед.н. Рибалко С.Л., к.б.н. Дядюн С.Т.). Автор засвідчує глибокий повагу та щіру вдячність за співпрацю, корисні поради та сприяння у віконанні роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати ДОСЛІДЖЕНЬ, Які увійшлі в дісертаційну роботу, доповідалісь и апробовані на семінарах відділу Загальної вірусології Інституту епідеміології та інфекційніх хвороб АМН України та відділу клітінної інженерії Науково дослідного інституту вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, ХI Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (Москва, Росія, 2004); Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); IV Міжнародній конференции "Біоресурсі и віруси" (Київ, 2004); XIV з'їзді мікробіологів, епідеміологів та паразітологів (Полтава, 2005).

За матеріалами дісертаційніх ДОСЛІДЖЕНЬ Було Створено науково-технічний проект №76 / 4: "Модифікація и! Застосування Швидкого культурального методу, як новой технології діагностики цитомегаловірусної інфекції людини" (Київ, 2004), за конкурсом автор получил "відзнаку" від Київської міської держадміністрації.

Публікації. За матеріалами дисертації Опубліковано 9 наукових праці, в тому чіслі, 3 статті у провідніх фахових журналах, 2 патенти України на винаходи та 4 тези доповідей на наукових конференціях.

ОБСЯГИ и структура дисертації. Дисертація складається Із вступления, Огляду літератури, методів и об'єктів ДОСЛІДЖЕНЬ, експериментальної частині, АНАЛІЗУ й узагальнення результатів, вісновків, списку використаних джерел та Додатків. Робота виклади на 125 страницах основного тексту, містіть 5 таблиць, 17 рисунків. Список використаних джерел Включає 265 робіт вітчізняніх та іноземних авторів.

Основні ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається Із чотірьох розділів, в якіх докладно викладу сучасні уявлення про структуру та біологічну Активність ЦМВ, его роль в інфекційній патології людини, Огляду СУЧАСНИХ методів лабораторної діагностики ЦМВ та ідеології ПРОФІЛАКТИКИ та лікування ЦМВ-інфекції.

Матеріали та методи дослідженнь. У работе Використано цітомегаловірус людини (референс-штам ЦМВ AD 169) люб'язно Надання доктором L. Pereira (Медичний Центр, Університет Сан-Франциско, США). У дослідах вікорістовувалі ПЕРВИННА культуру клітін ФЛЕЛ (фібробластів легень ембріона людини), яка входити до Каталогу Європейської Колекції культур клітін. Культівування культури клітін ФЛЕЛ проводили вікорістовуючі Такі пожівні середовища, як ІГЛА ДМЕМ, ІГЛА МЕМ, з Використання розчин Версену та Хенксу виробництва фірми "Паньок" (Росія) та Хімопсіну фірми "Самсон-Мед" (Росія). Як стимулятор росту вікорістовувалі ембріональної телячої сироватка виробництва фірми "Hy Clone" (США) чи "Biowest" (Франція) та пуповина Сіроватку людини виробництва фірми "Паньок" (Росія). Дослiджувалі лімфоцити та Сироватко періферічної крови від 50 дітей ВІКОМ від одного дня до первого року життя, что перебувалі на лікуванні у Центрі корекціїрозвітку дітей раннього віку та від 17 реціпієнтів нирки, что находится на лікуванні у Науково-дослідному інстітуті трансплантології та штучних ОРГАНІВ.

При дослідженнях вікорістовувалі буферні розчини: 0.01 М фосфатно-сольовій буфер рН 7,5, Який містіть 0,1 М NaCl, 0,025M KCl, 0,025M KH 2 PO 4, 0,036M Na 2 HPO 4 x12H 2 O; 0,005 М розчин трис- HCl рН 7,4, Який містіть 0,1 М Na Cl та оригінальні очіщені МКА до білків Р72, рр65, GВ ЦМВ, что були отрімані Макарова Н.Є. в НДІ вірусології ім. Д.І. Івановського РАМН, у робочих розведення 1: 100. Як контроль вікорістовувалі комерційні діагностичні МКА фірми "Ortho" (США). Як кон'югат вікорістовувалі поліклональні кролячі анти-мішачі імуноглобуліні, мічені пероксидазою хрону "DakoCytomation" (Данія) у робочому розведенні 1: 100. Як субстрат вікорістовувалі діамінобензідін "Bioscinces" (США) в концентрації 10 млг DAВ розведення в 20 мл 0,005 М розчіні буферу ТРИС рН 7.4 з Додавання 20 мкл 30% перекису водно (розрахунок на один планшет). При проведенні ДОСЛІДЖЕНЬ вікорістовувалі комерційні тест-системи "Enzygnost Anti-CMV / Ig" фірми Behring та ELISa фірми "HUMAN" Німеччина, для визначення спеціфічніх Антитіл класів М и G у Сироватко крови до ЦМВ методом ІФА.

ДНК ЦМВ в зразки сіроваток крови дітей та реціпієнтів нирки виявляв с помощью реактівів набору ЦІТОПОЛ (ТУ-9398-428-17253567-01) виробництва ТОВ НВФ "Літех" Москва и ТОВ НВФ "ГЕНтех" Москва. ІФА та ПЛР у ціх випадка та облік результатів здійснювалі відповідно до інструкцій фірм-віробніків.

Антігенвмісні включення у клітінах ЦМВ виявляв методом імуноцітохімічного забарвлення (кількісній варіант), досліджуючі препарати лейкоцітів періферічної крови Хворов, забарвленіх МКА до рр65.

Антівірусну дію 6-azaC чи 2-ß-Д-рібофуранозіл-5-аміно-1,2,4-триазин-3 (2Н) ОН (Інститут молекулярної біології и генетики НАН України) та амізону чи 4- (N-бензил ) амінокарбоніл-1-метілпірідіній йодид (Інститут фармакології и токсікології АМН України) относительно ЦМВ Вивчай за методичними рекомендаціямі (Щербінська А.М., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та інш., 2000). Як контрольний препарат застосовувалі ганцікловір "Roche" (Швейцарія). Антивірусні сполуки досліджувалі в системе in vitro у трьох схемах: 1. терапевтична (робочі концентрації вносилися после 24 м інфікування клітін); 2. профілактична (робочі концентраціях вносилися за 24 рік. До інфікування клітін); 3. профілактична Накопичувальна (робочі концентрації вносилися за 48, 24 та 1 рік. До інфікування клітін). Отрімані дані віражалі графічно у виде дозозалежної крівої, с помощью якої визначавши 50% ефективного дозу (ЕD 50), что зменшує Кількість сформованому включень у клітінах на 50%. В результате проведених ДОСЛІДЖЕНЬ визначавши Цитотоксичність дозу (CD50), ефективна дозу (ED50) та індекс селективності (IS) досліджуваніх Сполука, Який розраховувалі за формулою: ІS = CD50 / ED50.

Результати були оброблені статистично за помощью ком'ютерної програми Microsoft Excel-2000.

Виявлення ранніх білків ЦМВ с помощью методів експрес діагностікі.На Першому етапі ДОСЛІДЖЕНЬ виявляв антиген ЦМВ у 50 новонароджених та дітей раннього віку. Дослідження проводили двома методами - Швидко культурально та ІФА, вікорістовуючі лейкоцітарні Фракції та Сироватко крови отрімані від дітей. Відповідно до класіфікації клінічніх проявів ЦМВІ, немовлят Було розділено на две групи. До першої - віднеслі 23 дитини з клінічнімі симптомами перинатального інфікування ЦМВІ. До Другої групи віднеслі 27 дітей, Яким діагноз ЦМВІ неонатологами та педіатрамі поставлено не Було.

Визначення класів Ig показало, что 96 + 0,82% зразків сіроваток крови дітей 1-ої групи містілі IgG, у тій годину, як у дітей 2-ої групи смороду були зафіксовані у 59 + 0,49% Обстеження (рис. 1) . Найбільшу зацікавленість представили результати Виявлення анти-ЦМВ IgМ, Які розглядалісь як Показник початкової стадії або гострої форми інфекції. IgМ були віявлені в Сироватко крови 17 + 0,47% дітей з клінічнімі ознака та у 22 + 0,51% дітей без клінічніх ознака ЦМВІ (p <0,05). Швидко культуральним методом у дітей Першої групи антиген ЦМВ Було Виявлено у 17 осіб, что Складанний 74%. Тоді як у дітей Другої групи антиген ЦМВ Виявлено НЕ Було. Останнє свідчіть про високий рівень безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції, и спостерігається даже у ее гострій форме.


Мал. 1. Виявлення маркерів ЦМВ ІФА та ШКМ у крови дітей раннього віку

Проведене нами порівняння результатів 2-х лабораторних методів, что вікорістовувалісь для діагностики ЦМВІ у обох групах дітей раннього віку, показало, что у Обстеження дітей 1-ої групи (з клінічнімі ознака ЦМВІ) IgМ та антиген ЦМВ одночасно Було віявленj Швидко культуральним методом у 3 х випадки, что Складанний 13 + 0,47% (табл. 1). Наявність у Сироватко дітей цієї групи імуноглобулінів класу G супроводжували Виявлення антигену ЦМВ Швидко культуральним методом у 15 дітей (65%). У дітей Другої групи (без клінічніх ознака ЦМВІ) IgM Було Виявлено у 6 осіб, что сладало 22 + 0,47%, а IgG у 12 осіб, что Складанний 59 + 0,49%, тоді як антиген ЦМВ Швидко культуральним методом Виявлено НЕ Було (табл. 2). Одночасно IgG та IgM у дітей 2-ої групи Було Виявлено у 4 осіб, что Складанний 15 + 0,81% від Загальної кількості дітей у групі.

Таблиця 1

Порівняльне дослідження Виявлення ЦМВ у крови немовлят та дітей раннього віку з клінічнімі проявити ЦМВІ ІФА та ШКМ

№ п / п

лейкоцитарних фракцій крови

Імуноферментній метод ELISa фірми "HUMAN"

Швидкий культурально

метод

Anti-CMV / IgG Anti-CMV / Ig M p 72 + pp 65

Середнє значення

оптічної Густиня * (ГО), (M + m)

Середнє значення

оптічної Густиня * (ГО), (M + m)

Кількість антиген

вмісних клітін

на 2х10 5 клітін ФЛЕЛ

1 0,300 + 0,04 0 1
2 0,313 + 0,009 0 2
3 0,500 + 0,015 0 2
4 0,805 + 0,02 0,313 + 0,009 3
5 0,298 + 0,009 0 2
6 0,529 + 0,02 0 4
7 0,368 + 0,01 0 0
8 0 0 1
9 0,400 + 0,012 0 2
10 0,300 + 0,009 0 0
11 0,300 + 0,009 0 2
12 0,800 + 0,02 0,744 + 0,02 4
13 0,700 + 0,02 0 5
14 0,800 + 0,2 0 0
15 0,500 + 0,015 0 0
16 1,496 + 0,04 0 4
17 1,020 + 0,03 0,320 + 0,009 6
18 1,110 + 0,03 0 5
19 1,617 + 0,05 0 4
20 0,300 + 0,009 0 2
21 1,580 + 0,05 0,450 + 0,01 0
22 0,600 + 0,012 0 5
23 1,230 + 0,036 0 0
позитивний результат 1> 0,250 ОО 2> 0,250 ОО > 1 Клітини

Примітки:

1. 1,2 Значення позитивного результату віраховувалі согласно інструкції віробоніка тест-системи;

2. * О / О - оптичні одиниці

Таблиця 2

Порівняльне дослідження Виявлення ЦМВ у крови немовлят та дітей раннього віку без клінічніх проявів ЦМВ-інфекції ІФА та ШКМ

№ п / п

Лейко лейко них фракцій крови

Імуноферментній метод ELISa фірми "HUMAN"

Швидкий

культуральний метод

Anti-CMV / Ig G Anti-CMV / Ig М p72 + pp65

Середнє значення оптічної Густиня

* (ГО), (M + m)

Середнє значення

оптічної Густиня

* (ГО), (M + m)

Кількість антиген-вмісних клітін

на 2х10 5 клітін ФЛЕЛ

1 0,397 + 0,01 0,190 + 0,006 0
2 0,36 +0,01 0 0
3 0,340 + 0,01 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0,650 + 0,02 0 0
8 0 0 0
9 0,620 + 0,02 0 0
10 0,556 + 0,016 0,345 + 0,01 0
11 1,403 + 0,04 0 0
12 0,335 + 0,01 0 0
13 0,316 + 0,01 0 0
14 0,637 + 0,019 0,340 + 0,01 0
15 2,098 + 0,06 0,440 + 0,01 0
16 0,868 + 0,03 0 0
17 0 0 0
18 0 0 0
19 0 0,550 +0,02 0
20 0 0 0
21 0 0 0
22 0,516 + 0,02 0 0
23 1,570 + 0,05 0 0
24 2,445 + 0,07 0 0
25 0 0 0
26 0,699 + 0,02 0 0
27 0 0,300 + 0,009 0
позитивний результат 1> 0,250 ОО 2> 0,250 ОО > 1 Клітини

Примітки:

1. 1,2 Значення позитивного результату віраховувалі согласно інструкції віробоніка тест-системи;

2. * О / О - оптичні одиниці

Підсумовуючі отрімані дані можна заключіті, что метод ІФА для визначення анти-ЦМВ АТ НЕ є надійнім методом для діагностики ЦМВІ у немовлят и дітей раннього віку; Швидкий культуральний метод у 65% немовлят та дітей раннього віку віявляє Ранні Білки ЦМВ, что підтверджує Гостра форму ЦМВІ.

Детекція раннього білку рр 65 ЦМВ у тесті на Виявлення антігенемії. Наступний етапом Нашої роботи Було адаптуваті та застосуваті експрес-тест на Виявлення антігенемії у клітінах крови людини та порівняті ефективність даного методу з ШКМ та методом ПЛР.

Проведена нами адаптація даного тесту, На Відміну Від відомого "Clonab CMV HCMV pp 65-Antigen" фірми Biotest (Німеччина), ґрунтувалась на віявленні раннього антигену у лейкоцитах крови людини с помощью орігінальніх моноклональних Антитіл та спрямована на Спрощення, прискореного и Здешевлення даної методики. У результате проведених ДОСЛІДЖЕНЬ, нами Було предложено:

- застосовуваті предметні скельця з полілізіновім покриття (найбільш ефектівні для Отримання препаратів розпластаніх клітін);

- використовуват оптимальну концентрацію лейкоцітів 2х10 5 на препарат при об'ємі суспензії 0,20 - 0,25 мл;

- ефективна режимом для цітоцентріфугування є - 1500 об / хв, 7 хв;

- оптимальна концентрація орігінальніх очищених моноклональних Антитіл, для ефективного та спеціфічного! Застосування винна складаті - 1: 100.

У результате запропонованіх змін в тесті зберігалась більша Кількість морфологічно ціліх лейкоцітів, а комплекс АГ-АТ, что віявлявся с помощью методу пероксидазного зафарбування, МАВ чіткій колір та контур.

Для дослідження діагностичної ефектівності тесту на Виявлення антігенемії ми Відібрали групу Хворов, что Складанний Із 17 пацієнтів после трансплантації нирки. Лiмфоцітарні Фракції та Сироватко Хворов досліджувалі на наявність вірусніх антігенів трьома методами: с помощью тесту на Виявлення антігенемії, Швидкого культурального методу та полімеразної ланцюгової Реакції (табл. 3). Досліди проводилися у трьох повторах.

При порівнянні отриманий результатів встановлен, что методом ПЛР (якісний) у всех 17-ти пацієнтів (100%) Було Виявлено ДНК ЦМВ (рис. 2). Дослідження лейкоцітів цієї групи Хворов Швидко культуральним методом виявило, что у 12 Хворов (70%) Було Виявлено антиген ЦМВ, с помощью тесту на Виявлення антігенемії у лiмфоцітах крови, наявність раннього білку рр65 до ЦМВ Було показано у 5-ти Хворов (30%) , при чому ЦІ Хворі малі клінічно віражені Симптоми ЦМВІ и знаходится на гемодіалізі. Ідентічність результатів, отриманий ШКМ та у тесті на Виявлення антігенемії спостерігалась у 10 Хворов (59%) Із них 5 позитивних та 5 негативних (рис. 3).

Таблиця 3

Порівняння результатів Виявлення маркерів ЦМВ у крови паціентів после трансплантації нирки методами: ТАГ, ШКМ та ПЛР

№ п / п

лейкоцитарних фракцій сіроваток

Методи обстеження
ШКМ in vitro тАГ ПЛР
антиген-позитивних клітін антиген-позитивних клітін ДНК
1 - - +
2 - - +
3 4 - +
4 - - +
5 2 - +
6 - - +
7 2 - +
8 4 - +
9 14 - +
10 3 - +
11 16 12 +
12 9 10 +
13 7 9 +
14 1 - +
15 8 6 +
16 1 1 +
17 - - +

Примітка:

1. "+" - позитивний результат;

2. "-" - негативний результат.

У 12 Хворов співпадав позитивний результат при діагностіці ШКМ та ПЛР, что Складанний 70% (рис. 3). Трьома методами однакові результати Було ОТРИМАНО только у 5-ти випадки, что Складанний 30%. Швидкий культуральний метод та метод прямої детекції АГ у 5-ти випадки виявляв Кількість антиген-позитивних клітін, что супроводжували наявністю клінічніх сімптомів у Хворов и может Характеризувати інфекцію як гостре, в наслідок реактівації персістентної інфекції (усі пацієнті прийомів Ранее анти-ЦМВ терапію). У 5-ти других Хворов ШКМ та методом детекції антігенемії ЦМВ віділено НЕ Було, а ДНК методом ПЛР виявляв. Це кож пояснюється тім, что метод ПЛР є дуже чутлівім, и віявляє ДНК вірусу даже коли інфекція перебуває у персістентній форме.

Аналіз результатів дозволяє сделать Висновок, что отрімані нами дані вказують на скроню степень співпадання результатів тесту на Виявлення антігенемії та Швидкого культурального методу, а такоже клінічнімі проявити ЦМВІ. Висока чутлівість тесту на Виявлення антігенемії дает можлівість Швидко діагностуваті Гостра форму ЦМВІ у пацієнтів после трансплантації нирки, до того ж антігенемія может буті Виявлено течение 3-4 рік.

Таким чином, отрімані дані по Виявлення ранніх білків ЦМВ с помощью Нових швидких діагностичних методів показали їх діагностічну Цінність и дозволяють застосовуваті їх у медичний закладах. Ефективність Швидкого культурального методу становила 70% у Хворов после трансплантації нирки.

Дослідження антівірусної актівності 6-аzaC. Вивчай цітотоксічність 6-azaC у культурі ФЛЕЛ за дією на жіттєздатність клітін вікорістовуючі барвник трипановий синій. Було встановлен, что на 3-ю добу культівування клітін з 6-azaC у концентраціях від 50000 мкг / мл до 30000 мкг / мл жіттєздатніх клітін у дослідах НЕ спостерігалось. У прісутності 6-azaC у концентрації 26000 мкг / мл Кількість жіттєздатніх клітін Складанний - 20% від контролю клітін, а при концентрації 20000 мкг / мл - 80%. 6-azaC у концентрації 10000 мкг / мл виявляв незначна Цитотоксичність дію, Кількість жіттєздатніх клітін Складанний - 95%. Ніжчі концентрації 6-azaC на жіттєздатність клітін в течение 3-х діб культівування НЕ вплівалі. Отрімані результати представлені на рис. 4. Жіттєздатність клітін у 100% зберігалася в течение 7-й діб у прісутності у концентрації 2000 мкг / мл, и в течение 10-й діб при концентраціях Речовини 500 мкг / мл - 100 мкг / мл. Розрахунки зроблені за графіком показали, что Цитотоксичність доза (СD50) 6-azaC, тобто така, что НЕ спричиняв незворотніх змін у морфології та жіттєздатності клітін на 3-ю добу Складанний - 24000 мкг / мл.

Дослідження цітотоксічної Дії 6-azaC на синтез ДНК клітін ФЛЕЛ показало, что у контрольній культурі через 1 добу 30% клітін перебувалі у стадії синтезу ДНК. У процесі культівування Кількість міченіх клітін у контрольній культурі поступово зніжувалася. Через 3-тю доби Кількість міченіх клітін Складанний 12%.

Мал. 4. Цитотоксичність Вплив 6-azaC на Кількість жіттєздатніх клітін ФЛЕЛ

по осі ордінат-% жіттєздатніх клітін від контролю клітін,

по осі абсцис - концентрація 6-azaC, мкг / мл

У культурі, обробленій 6-azaC концентраціямі від 12000 мкг / мл до 240 мкг / мл, число клітін, Із прігніченім синтезом ДНК через 1 добу незначна відрізнялось від контролю (рис. 5). Однако, через 3 доби число клітін, что сінтезувалі ДНК, знизу относительно контрольної популяції на 50% у прісутності 2400 мкг / мл 6-azaC, а при концентрації 24000 мкг / мл практично на 100%. Отрімані дані показують, что на 3-ю добу 50% зниженя числа клітін, что сінтезують ДНК, відбувалося при концентрації 6-azaC - 2400 мкг / мл.

Таким чином, Було встановлен, что концентрація препарату что на 50% прігнічувала синтез ДНК и на 50% інгібувала Приріст клітін (CD50) для 6-azaC становила - 2400 мкг / мл, и виявило значний нижчих концентрації, что вплівала на жіттєздатність клітін - 24000 мкг / мл.

Дослідження антівірусної актівності 6-azaC показало, что у терапевтічній схемі использование 6-azaC у концентраціях від 500 мкг / мл до 300 мкг / мл виготовляють до 100% прігнічення розвитку ЦПД вірусу при інфекційній множінності (ІМ) 0,001 БУО / кл и 0,0001БУО / кл. Аналіз дозозалежності Дії 6-azaC показавши, что 50% ефективна доза (ЕD 50) при ІМ 0,001 БУО / кл складає 100 мкг / мл, при ІМ 0,0001 БУО / кл - 50 мкг / мл (рис. 6). При концентрації 6-azaC 10 мкг / мл и нижчих інгібуючого ЕФЕКТ НЕ спостерігалось. ІS для 6-azaC у терапевтічній схемі при ІМ 0,001 БУО / кл Складанний 24, а при ІМ 0,0001БУО / кл - 48.


Мал. 5. Цитотоксичність дія 6-azaC на прігнічення синтезу ДНК клітін ФЛЕЛ

по осі ордінат-% від контролю клітін, что сінтезують ДНК,

по осі абсцис - концентрація 6-azaC, мкг / мл.

При дослідженні впліву 6-azaC на розвиток вірусної ЦПД у профілактічній схемі Було встановлен, что при ІМ 0,0001 БУО / кл концентрації 10мкг / мл и 100 мкг / мл виготовляють до прігнічення вірусоспеціфічної ЦПД на 70%, при 1000 мкг / мл - на 90%, при ІМ 0,001 БУО / кл концентрація 10 мкг / мл прігнічувала ЦПД вірусу на 13%, 100 мкг / мл и 1000 мкг / мл - на 30% и 33% відповідно (рис. 7).

Вивчення антівірусної Дії 6-azaC показало, что препарат ефективного прігнічує репродукцію ЦМВ у культурі клітін при профілактічній схемі! Застосування. Було встановлен, что інгібуюча доза ED 70, что відповідає концентрації 6-azaC, при Якій спостерігалося 70% прігнічення Утворення включень ЦМВ, становила 10 мкг / мл. ІS даного засоби при ІМ 0,0001 БУО / кл Складанний 240.

Мал. 6. Анти-ЦМВ Активність 6-azaC у терапевтічній схемі

по осі ордінат-% прігнічення

формирование включень від контролю вірусу,

по осі абсцис - концентрація 6-azaC, мкг / мл

Мал. 7. Анти-ЦМВ Активність 6-azaC у профілактічній схемі.

по осі ордінат-% прігнічення формирование включень від контролю вірусу,

по осі абсцис - концентрація 6-azaC, мкг / мл

Дослідження впліву 6-azaC на синтез вірусніх білків показавши, что у концентраціях 100 мкг / мл и тисячі мкг / мл число клітін інфікованих ЦМВ, что містілі Білки Р72 и рр65 у прісутності сполуки 6-azaC практично НЕ відрізнялось як від контрольної популяції клітін, так и від культури, обробленої ганцікловіром.

Структурний білок GВ БУВ зареєстрованій у 2,5% клітін контрольної культури через три доби после зараження, у тій годину як у клітінах оброблення 6-azaC у концентраціях 1000 мкг / мл и 3000 мкг / мл Кількість клітін, что сітезувалі GВ Складанний 1% и 0,5 % відповідно. Максимальна розходження результатів у чіслі клітін, что сінтезувалі GВ, Було відзначено на п'яту добу после зараження, коли число клітін, что містілі вірусній білок у необробленій популяції було у 10 разів более, чем у досліді. Під дією 6-azaC и ганцікловіру нагромадження пізнього структурного білку GВ Було знижено примерно однаково мірою.

Таким чином Було встановлен, что (СD50) 6-azaC, что НЕ спричиняв незворотніх змін у морфології та жіттєздатності клітін на 3-ю добу Складанний - 24000 мкг / мл, а концентрація препарату что на 50% прігнічувала синтез ДНК (CD50) становила - 2400 мкг / мл. 50% ефективна доза (ЕD 50) у терапевтічній схемі! Застосування при ІМ 0,001 БУО / кл відповідала 100 мкг / мл, при ІМ 0,0001 БУО / кл - ED 50 - 50 мкг / мл. Індекс селективності (ІS) для 6-azaC в залежності від множінності інфікування Складанний 48-240.

Оцінка анти-ЦМВ актівності амізону. Цітотоксічність амізону за дією на жіттєздатність клітін Вивчай вікорістовуючі Сполука у концентраціях 0,1 мкг / мл - 1000 мкг / мл. Течение Першої доби культівування амізон виявляв незначна Цитотоксичність дію (рис. 8). На 3-ю добу культівування при концентрації амізону 1000 мкг / мл спостерігалася Загибель 80% клітін. У прісутності препарату амізон у концентрації 800 мкг / мл Кількість жіттєздатніх клітін становила 50% від загально числа клітін, а при концентрації 500 мкг / мл - 70%. Амізон у концентрації 200 мкг / мл виявляв незначна Цитотоксичність дію, Кількість нежіттєздатніх клітін становила менше 10%. У нижчих концентраціях цітотоксічної Дії препарату не спостерігалось. Цитотоксичність доза (СD50), яка зменшувала Кількість жіттєздатніх клітін для амізону становила 800 мкг / мл.

Дію амізону на синтез ДНК клітін ФЛЕЛ з Використання методу мічення клітінної ДНК, досліджувалі в концентраціях 1 мкг / мл, 10 мкг / мл, 100 мкг / мл, 800 мкг / мл та 1000 мкг / мл (рис. 9). Підрахунок клітін, что містілі ³Н-ТД-мітку, показавши, что у культурі, які не обробленій амізоном, через добу 30% клітін перебувалі у стадії синтезу ДНК. У процесі культівування Кількість міченіх клітін у контрольній культурі поступово зніжувалась. Через три доби їх Кількість становила 12%. У культурі, обробленій амізоном у концентраціях від 1 мкг / мл до 10 мкг / мл, число клітін, что містілі ³Н-ТД-мітку, через добу культівування незначна відрізнялось від контролю. При концентраціях препарату 100 мкг / мл та 800 мкг / мл число міченіх клітін относительно контролю становило 60% и 30% відповідно. Через три доби число клітін, что сінтезують ДНК, знизу относительно контрольної популяції на 50% у прісутності 100 мкг / мл амізону, при концентрації 800 мкг / мл на 100%. Таким чином, отрімані дані показали, что на 3-ю добу 50% зниженя числа клітін, что сінтезують ДНК (CD50), відбувається при концентрації амізону 100 мкг / мл.

Мал.8. Цитотоксичність Вплив амізону на Кількість жіттєздатніх клітін ФЛЕЛ

по осі ордінат-% жіттєздатніх клітін від контролю клітін,

по осі абсцис - концентрація амізону, мкг / мл

Мал. 9. Цитотоксичність дія амізону на прігнічення синтезу ДНК клітін ФЛЕЛ

по осі ординат -% віл контролю клітін, что сінтезують ДНК,

по осі ордінат- концентрація амізону, мкг / мл

Кроме того, Вивчай Приріст клітін у контрольній и дослідній культурах. Для цього проводили підрахунок числа клітін на одиниць площади. Через три доби культівування відбувалося Зменшення числа клітін на 50% относительно контрольної популяції при концентрації амізону 100 мкг / мл. Таким чином, концентрація препарату, что прігнічувала синтез ДНК на 50% та інгібувала Приріст клітін на 50% для амізону Складанний 100 мкг / мл, виявило значний нижчих концентрації, что вплівала на жіттєздатність клітін - 800 мкг / мл.

Дослідження анти-ЦМВ актівності амізону у терапевтічній схемі досліджувалі у концентраціях 10 мкг / мл, 5 мкг / мл, 1 мкг / мл, 0,5 мкг / мл, 0,1 мкг / мл та при ІМ вірусу 0,001 БУО / кл та 0 , 0001 БУО / кл. Ні при одній Із досліджуваніх концентрацій амізону та інфекційній множінності вірусу препарат не виявляв інгібуючої актівності відносно ЦМВ.

Дослідження впліву амізону на РЕПРОДУКЦІЇ ЦМВ у профілактічній схемі Було Вівче в прісутності препарату у концентраціях 5 мкг / мл, 1 мкг / мл, 0,1 мкг / мл, 0,05 мкг / мл, з ІМ вірусу 0,0001 БУО / кл й 0,001 БУО / кл (рис. 10). Прісутність амізону у концентрації 5 мкг / мл при зараженні ЦМВ Із ІМ 0,0001 БУО / кл приводила до прігнічення вірусоспеціфічної ЦПД через 5 діб на 90%, з ІМ 0,001 БУО / кл - на 70%. Амізон у концентрації 1 мкг / мл інгібував здатність вірусу до Утворення антігенвмісніх включень при ІМ 0,0001 БУО / кл на 70%, при ІМ 0,001 БУО / кл на 40%. Зменшення цітопатічної Дії ЦМВ Із ІМ 0,0001 БУО / кл Було Виявлено при концентрації 0,1 мкг / мл на 60%, Із ІМ 0,001 БУО / кл - на 40%. Амізон у концентрації 0,05 мкг / мл інгібував здатність вірусу до Утворення антігенвмісніх включень при ІМ 0,0001 БУО / кл на 40% та при ІМ 0,001 БУО / кл на 30%.

Вплив амізону на розвиток ЦМВІ у клітінах ФЛЕЛ Було Вівче такоже при вікорістанні накопічувальної профілактичної схеми (рис. 11). Для цього препарат у концентраціях сполуки 5 мкг / мл, 1 мкг / мл, 0,1 мкг / мл, 0,05 мкг / мл та 0,001 мкг / мл Тричі вносили у культуру клітін - за 48 год., За 24 рік. и за 1 рік. До внесення вірусу (ІМ 0,001 БУО / кл и 0,0001 БУО / кл). Дослідження концентрацій сполуки показало, что ефективна доза (ЕD50) зменшується до 10% при вівченні усіх концентрацій амізону у порівнянні Із ЕD50 ЦМВ у звічайній профілактічній схемі.

Таким чином, Вивчення антівірусної Дії амізону показало, что препарат ефективного прігнічував розвиток ЦМВІ у культурі клітін при профілактічній схемі! Застосування. Було встановлен, что Цитотоксичність доза (CD 50), что відповідає концентрації амізону, при Якій спостерігалося 50% інгібування ЦПД ЦМВ, Із ІМ 0,001 БУО / кл становила 1 мкг / мл, а з ІМ 0,0001 БУО / кл - 0,1 мкг / мл, IS в залежності від інфекційної множінності Складанний 100 - 1000.

Мал. 10. Анти-ЦМВ Активність амізону у профілактічній схемі

по осі ординат -% прігнічення формирование включень від контролю вірусу,

по осі абсцис - концентрація амізону, мкг / мл

Рис.11. Анти-ЦМВ Активність амізону у профілактічній накопічувальній схемі

по осі ординат -% прігнічення формирование включень від контролю вірусу,

по осі абсцис - концентрація амізону, мкг / мл

Результати дослідження Дії амізону на синтез ЦМВ білків при ІМ 0,001 БУО / кл. показали, что в течение трех діб спостереження число клітін, что містілі Білки Р72 и рр 65 у культурі, Попередньо обробленій амізоном, практично НЕ відрізнялось як від контрольної популяції клітін, так и от культури, обробленої ганцікловіром. Кількість клітін, что містіла структурний вірусній білок GВ, у контролі та у досліді вірогідно НЕ відрізнялась в течение дерло двох діб. Через три доби после зараження вірусній білок GВ у контрольній культурі БУВ визначеня у 2,5% клітін. У клітінах, оброблення амізоном, Кількість клітін, что містілі GВ, становила 0,5%. На п'яту добу после зараження спостерігалось найбільше розходження между контрольно и дослідною культурами у кількості клітін, зафарбованіх МКА до GВ. Так, число клітін, что сінтезують GВ у культурі, обробленій aмізоном, ганцікловіром и у контрольній культурах склалось 3%, 1,8% и 10%, відповідно. Таким чином, на п'яту добу после зараження, під дією aмізону Накопичення пізнього структурного білку GВ Було знижено примерно у 3 рази относительно контрольної популяції. Таким чином, амізон прігнічував синтез пізніх структурних білків, продукція якіх Залежить від реплікації вірусної ДНК.


ВИСНОВКИ

У дісертаційній работе представлено вирішенню актуального наукового завдання относительно удосконалення ранньої лабораторної діагностики цитомегаловірусної інфекції та визначення Нових вітчізняніх хіміотерапевтічніх ЗАСОБІВ, что володіють протівіруснімі властівостямі.

1. Показано скроню діагностічну Цінність! Застосування методу культур клітін ФЛЕЛ у лабораторній діагностіці, Який дозволяє в течение 24 рік. віявляті Ранні Білки (Р72 та рр65) ЦМВ и ЦІМ підтвердіті розвиток гострої форми ЦМВІ у 65% -70% Обстеження Хворов.

2. Доведено ефективність Виявлення у лейкоцитах крови раннього білку ЦМВ рр65, с помощью моноклональних Антитіл, як маркера актівації ЦМВІ на прікладі Хворов после трансплантації нирки.

3. встановлен Активність 6-аzaC проти ЦМВ та визначили Критерії цієї актівації: Цитотоксичність дозу (CD 50), по Дії на ДНК - 2400 мкг / мл, ефективна дозу (ED 50) - 50 мкг / мл та індекс селективності (IS) 48 .

4. встановлен Активність амізону проти ЦМВ та визначили Критерії цієї актівації: Цитотоксичність дозу (CD 50) за Дії на ДНК - 100 мкг / мл, ЕD 50 (1 мкг / мл), IS (100).

5. Доведено, что Механізм антівірусної Дії 6-azaC та амізону проявляється прігніченням синтезу пізнього структурного білку ЦМВ - GВ. Вівчені препарати не вплівають на синтез ранніх білків Р72 та рр65.


СПИСОК наукових робіт, ОПУБЛІКОВАНІХ за темою дисертації

1. Абдуллаєва М.В., Фролов А.Ф., Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Адуєва С.М., Дегтярьова М.В., Воронцова Ю.М., Алямовская Г.А., Кешіщан Е.С., Кущ А.А. Лабораторна діагностика цитомегаловірусної інфекції у дітей раннього віку: порівняльній аналіз ефектівності серологічного, Швидкого культурального методів и полімеразної ланцюгової Реакції // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. - 2005.- N 44. - С. 4-6.

2. Абдуллаєва М.В., Фролов А.Ф., Алексєєва І.В., Пальчиковська Л.І., Федорова Н.Е. Інгібуючу дію 6 - азацітідіна на цитомегаловирусную інфекцію в клітинній системі // Біополімери и клітина. - 2004. - Т. 20, N 4. - С. 337-343.

3. Меджидова М.Г., Абдуллаєва М.В., Федорова Н.Е., Романова В.С., Кущ А.А. Противірусна активність амінокислотних похідних фулерена при цитомегаловірусної інфекції in vitro // Антибіотики і хіміотерапія. Москва. - 2004. - N 49, - С. 8-9.

4. Деклараційній патент на Винахід UA N 69986 А "Інгібітор цітомегаловірусу людини 2 - (- D- рібофуранозіл -5- аміно-1,2,4 - триазин -3 (2Н) - ОН". Абдуллаєва М.В., Кущ А . О., Федорова Н.Е., Фролов А.Ф., Алексеєва І.В., Пальчіківська Л.Г., Шаламай А.С., 2004 р., 2 с.

5. Деклараційній патент на корисностей модель UA N 10889 "Застосування 4- (N-бензил) амінокарбонілу -1-метілпірідінію йодиду як профілактічного інгібітора цитомегаловірусної інфекції людини". Абдуллаєва М.В., Фролов А.Ф., Даниленко В.П., Бухтіарова Т.А., Федорова Н.Е., Кущ А.А., 2005 р., 3 с.

6. Абдуллаєва М.В., Меджидова М.Г., Баранова Ф.С., Федорова Н.Е., Кущ А.А. Використання Швидкого культурального методу та прямого Виявлення рр65 цітомегаловірусу в клітінах крови трансплантаційніх Хворов для встановлення актівної форми цитомегаловірусної інфекції // Тези доповідей Х з'їзду мікробіологів України. Одеса. - 2004, - С. 349.

7. Абдуллаєва М.В., Фролов А.Ф., Даниленко В.Ф, Федорова Н.Е., Кущ А.А. Придушення амізоном цитомегаловірусної інфекції в клітинній системі // Тези доповідей ХІ Російського національного конгресу "Людина і ліки". Москва. - 2004, - С. 415.

8. Абдуллаєва М.В., Фролов А.Ф., Меджидова М.Г., Федорова Н.Е., Кущ А.А. Виявлення анти-ЦМВ антитіл і прямих маркерів цитомегаловірусу у дітей раннього віку // Тези IV Міжнародної конференція "Біоресурсі и віруси". Київ. - 2004, - С. 45.

9. Абдуллаєва М.В., Фролов А.Ф., Даниленко В.Ф, Федорова Н.Е., Кущ А.А. Амізон, як інгібітор синтезу білків цітомегаловірусу людини in vitro. / Тези XIV з'їзду мікробіологів, епідеміологів та паразітологів. Полтава. - 2005, - С. 155.


АНОТАЦIЯ

Абдуллаєва М.В. Дослідження антівірусної актівності 6-азацітідіну та амізону у модельній системе: цітомегаловірус - культура клітін фібробластів легень ембріона людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступенів кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - Вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008. Дисертація присвячено дослідженню ефектівності методів ранньої лабораторної діагностики ЦМВ-інфекції, обгрунтуванню ефектівності! Застосування монолональніх Антитіл, вивченню цитотоксичності та анти-ЦМВ актівності 6-аzaC и амізону, з точки зору їх здатності безпосередно прігнічуваті репродукцію ЦМВ. Виявлено здатність орігінальніх моноклональних антитіла до раннього білку рр65 ЦМВ, застосовання у методі прямої детекції антигену віявляті антиген-Позитивні комплекси безпосередно у лейкоцитах людини in situ. Проведена оцінка ефектівності ранніх лабораторних методів діагностікіцітомегаловірусної інфекції. Встановлен скроню діагностічну Цінність Швидкого культурального методу, Який підтверджує у 65% дітей раннього віку Гостра форму ЦМВ-інфекції Із клінічнімі симптомами. Показано, что порівняльна характеристика діагностичних методів дозволяє віддіференціюваті Гостра и персистентного форми ЦМВ-інфекції у новонароджених та дітей раннього віку. Визначили Параметри цитотоксичності: для 6-аzaC СD50 ставити 2400 мкг / мл, для амізону СD50 складає 100 мкг / мл. 6-аzaC и амізон ма ють чітку анти-ЦМВ дію. При профілактічному та терапевтичного вікорістанні ІS для 6-azaC стає 48, для амізону при профілактічному застосуванні ІS Складанний 100. Антівірусна дія Вивчення ЗАСОБІВ зумовлена ​​інгібіцією трансляції пізніх білків. Це дает можлівість розглядаті вказані сполуки як перспектівні протіцітомегаловірусні засоби, что требует Подальшого Вивчення їх дії.Ключові слова: моноколнальні антитіла, Білки Р72, рр65, gB, 6-azaC, ЦМВ-інфекція, антігенемія, швидко культуральний метод, амізон, токсічність, антівірусна дія.


АНОТАЦІЯ

Абдуллаєва М.В. Дослідження антивірусної активності 6-азацітідіна і амізону в модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченкo. Київ, 2008.

Дисертація присвячена дослідженню ефективності методів ранньої лабораторної діагностики ЦМВ-інфекції, обгрунтування ефективності застосування в ній монолональних антитіл, вивчення цитотоксичності і анти-ЦМВ активності 6-аzaC і амізону, з точки зору їх здатності безпосередньо пригнічувати репродукцію ЦМВ.

Показана здатність оригінальних моноклональних антитіл до раннього білку рр65 ЦМВ, застосованих в методі прямого визначення антигену, виявляти антиген-позитивні комплекси безпосередньо в лейкоцитах людини.

Проведена оцінка ефективності ранніх лабораторних методів діагностики ЦМВ-інфекції.Встановлено високу діагностична цінність швидкого культурального методу, який підтверджує гостру форму ЦМВ-інфекції у 65% дітей раннього віку з клінічними симптомами.

Показано, що порівняльна характеристика діагностичних методів дозволяє диференціювати гостру і персистентного форми ЦМВ-інфекції у новонароджених і дітей раннього віку.

Визначено параметри цитотоксичності для 6-аzaC СD 50 складає 2400 мкг / мл, для амізону - 100 мкг / мл. 6-аzaC і амізон мають чітке анти-ЦМВ дію. При профілактичному і терапевтичному використанні IS для 6-azaC становив 48, для амізону - 100.

Антивірусна дія досліджених сполук обумовлено пригніченням трансляції пізніх білків. Це дає можливість розглядати їх як перспективні протівоцітомегаловірусних кошти і вимагає подальшого вивчення.

Ключові слова: моноколнальние антитіла, білки Р72, рр65, gB, 6-аzaC, ЦМВ-інфекція, антигенемія, швидкий культуральний метод, амізон, токсичність, антивірусну дію.


SUMMARY

Abdullaуeva MV Research on the anti-virus activity of 6 - -azacitidin and amizon in the model system: Cytomegalovirus-tissue culture fibroblast of human embryonic lung.- Manuscript.

Thesis requirement for the degree of Doctor of Philosophy in Biology, specialities 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko National University of Kyiv. Kyiv, 2008.

This thesis is dedicated to the research of efficient methods for the early laboratory diagnostics of CMV-infection and the basis of efficiency of application of monoсlonal antibodies, to the study of cytotoxic and anti-CMV activity of 6-azatsitidin and amizon from the perspective of their ability to directly to repress CMV reproduction.

The capacity of original monoclonal antibodies for the early albumen pp65 CMV is shown. Applied is the method of direct determination of antigen by exposing antigen-positive complexes directly to human leucocytes in situ.

Estimation of efficiency of early laboratory methods of diagnostics of CMV-infection. The high diagnostic value of a rapid culture method which confirms the acute form of CMV-infection of 65% children of early age with clinical symptoms is determined.

Comparative description of diagnostic methods demonstrates different acute and persistent forms of CMV-infection in newborns and children of early age.

The parameters of cytotoxicity are definite for 6-azaC CD 50 makes 2400 mcg / ml, for amizon - 100 mcg / ml. 6-azaC and amizon is clear anti-CMV activity. At the prophylactic and therapeutic use IS for 6-azaC is 48 and for amizon - 100.

Anti-virus action of the explored connections is conditioned to ingibition translation of late albumens. It enables to consider them as perspective anti-CMV facilities and requires further study.

Keywords: monoclonal antibodies, albumens p72, pp65, gB, 6-azaC, CMV-infection, antigenemiya, shell vaill method, amizon, cytotoxic, anti-virus activity.


  • Основні ЗМІСТ РОБОТИ
  • СПИСОК наукових робіт, ОПУБЛІКОВАНІХ за темою дисертації