Аденілатціклазную сигнальний механізм






    Головна сторінка





Скачати 91.47 Kb.
Дата конвертації06.04.2017
Розмір91.47 Kb.
Типавтореферат

50

Аденілатціклазную СИГНАЛЬНИЙ МЕХАНІЗМ ДІЇ ПЕПТИДІВ ІНСУЛІНОВОГО суперсімейства У хребетних І БЕЗХРЕБЕТНИХ

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Санкт-Петербург 2007

Актуальність проблеми

Вивчення гормональних сигнальних систем, що беруть участь в регуляції життєво важливих для організму клітинних процесів, є однією з актуальних проблем сучасної молекулярної ендокринології та біохімії. До числа систем, що здійснюють реалізацію регуляторного дії речовин гормональної та негормональной природи, відноситься аденілатціклазную сигнальна система (АЦС), яка представлена ​​в клітці складним трансмембраним комплексом, що складається, принаймні, з трьох молекулярних блоків. Необхідними компонентами АЦС є: рецептори, здатні сприймати позаклітинні сигнали, гетеротрімерние ГТФ-зв'язуючі білки (G-білки) стимулюючого (Gs) або інгібуючої (Gi) типу, що складаються з трьох субодиниць -?,,? і забезпечують сполучення між рецептором і третім компонентом системи - ферментом аденилатциклазой (АЦ), що каталізує утворення універсального внутрішньоклітинного посередника - циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ). За його участю здійснюється реалізація цілої низки регуляторних ефектів в клітці (проліферація, диференціювання, апоптоз, синтез білка і ін.).

До теперішнього часу в літературі накопичено значний обсяг даних, що свідчать про участь АЦС і цАМФ в трансдукції сигналів групи гормони не пептидної природи (серотонін, адреналін, норадреналін і ін.), Які здійснюють свій ефект на клітину через рецептори серпантинового типу, сім раз пронизують мембрану. В рамках цього дослідження ми зробили спробу з'ясувати можливість участі АЦС в реалізації дії пептидів інсулінового суперсімейства, що володіють рецепторами тірозінкіназной типу, один раз пронизують мембрану клітини. До досліджень, проведених нами, участь системи АЦС-цАМФ в реалізації дії гормонів інсулінової природи практично заперечувалося. У літературі були лише окремі відомості про вплив інсуліну, бомбіксіна, релаксину на активність АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004). Незважаючи на успіхи, досягнуті за останні десятиліття у вивченні молекулярних механізмів дії інсуліну і інсуліноподібний пептидів, багато аспектів плейотропних дії цього гормону і споріднених йому пептидів досі залишаються нез'ясованими (Pertseva et al., 2003; Телкова, 2005). У зв'язку з цим вивчення раніше невідомих молекулярних механізмів дії пептидів інсулінового суперсімейства, що нараховує в даний час близько 50 представників, відноситься до числа актуальних проблем сучасної ендокринології. Відповідно до сучасних уявлень, інсулін і споріднені з ним пептиди грають ключову роль в регуляції ряду клітинних процесів - клітинний ріст, апоптоз, метаболізм. Ці пептиди мають загальне еволюційне походження, так як виникли в ході еволюції із загального анцестральной гена в результаті дуплікації і подальшої дивергенції утворилися генетичних ліній, зберігши при цьому структурний і функціональну подібність (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992 ).

До вивчення участі АЦС в реалізації дії гормонів і ростових факторів інсулінової природи лабораторія приступила на початку 90-х років. Відправною точкою послужили дані, вперше отримані нами, про здатність інсуліну та споріднених пептидів активувати ГТФ-залежним чином АЦ в м'язових тканинах ссавців і молюсків (Plesneva et al., 1994). Ми використовували еволюційний підхід, запропонований Л.А. Орбелі (1958) стосовно до еволюційної біохімії, який включав дослідження в філогенезі, онтогенезі та при патології. Було вивчено: 1) вплив на АЦС інсуліну, інсуліноподібного чинника зростання 1 (ІФР-1) хребетних і інсуліноподібного пептиду (ІПП) безхребетних (молюск Anodonta cygnea; 2) вплив на АЦС пептидів в тканинах-мішенях тварин різного філогенетичного рівня (хребетні - щури , птиці та безхребетні - молюски); 3) дія пептидів інсулінового суперсімейства на АЦС в онтогенезі (в тканинах курячих ембріонів різного віку і у курчат); 4) дія пептидів інсулінового суперсімейства на АЦС при експериментальному діабеті у хребетних і безхребетних.

Мета роботи. Довести участь аденілатціклазной сигнальної системи в реалізації регуляторних ефектів інсуліну, ІФР-1, ІПП молюска в клітці і розшифрувати структурно-функціональну організацію АЦ сигнального механізму їх дії в тканинах хребетних і безхребетних, а також встановити роль АЦ сигнального механізму в регуляції фундаментальних клітинних процесів - клітинний зростання, апоптоз.

Завдання дослідження

1. Дослідити дію інсуліну, ІФР-1 та ІПП, виділеного з вісцеральних органів молюска Anodonta cygnea (Русаков та ін., 1991), на АЦС в м'язових тканинах хребетних і безхребетних. Охарактеризувати залежність ефекту від часу і концентрації досліджуваних пептидів, а також від присутності гуанінових нуклеотидів для підтвердження залучення в АЦ сигнальний механізм гетеротрімерних G-білків.

2. Дослідити структурно-функціональну організацію АЦ сигнального механізму, опосередковують ефекти пептидів інсулінового суперсімейства у хребетних і безхребетних і з'ясувати послідовність етапів передачі регуляторних сигналів цих пептидів на АЦС. З цією метою: а) встановити тип рецепторів і G-білків, залучених до АЦ сигнальний механізм дії пептидів, використовуючи інгібітори рецепторних тирозинкіназ і метод АДФ-рибозилювання бактеріальними токсинами; б) виявити участь фосфатидилинозитол-3 кінази (ФМ-3-К), використовуючи специфічний інгібітор вортманнін; в) ідентифікувати ізоформу протеїнкінази «С» (ПКС); використовуючи інгібітори ПКС і моноклональні антитіла до ізоформами ПКС.

3. Дослідити участь АЦ сигнального механізму дії інсуліну і ІФР-1 в регуляції процесів клітинного росту і апоптозу, виходячи з гіпотези про важливу роль цАМФ в регуляції фундаментальних процесів в клітині (Перцева, 2000).

4. Дослідити функціональні порушення в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінового суперсімейства при ендокринної патології - цукровий діабет 1-го і 2-го типів.

Наукова новизна

Вперше виявлено стимулюючу дію інсуліну, ІФР-1 та ІПП молюска A. cygnea на активність АЦ. Показано участь рецепторной тирозинкінази і встановлена ​​залученість G-білків (Gi) і (Gs) типу в реалізацію активуючого дії цих пептидів на АЦ. Вперше показано, що в прояві АЦ стимулюючих ефектів інсуліну і ІФР-1 беруть участь ФІ-3-К і ізоформи ПКС - ПКС і можливо ПКС ?.

В м'язових тканинах хребетних і безхребетних тварин виявлено раніше невідомий АЦ сигнальний механізм дії інсуліну і ІФР-1 і встановлена ​​його структурно-функціональна організація, представлена ​​в клітці наступної сигнальної ланцюгом: рецептор тірозінкіназной типу Gi-білок (? -дімер) ФМ-3-К ПКС (хребетні) або ПКС? (Безхребетні) Gs-білок АЦ цАМФ протеинкиназа «А» (ПКА) ефекторні системи. Цей механізм відрізняється за кількістю сигнальних блоків від відомого АЦ сигнального механізму дії гормонів, що володіють рецепторами серпантинового типу, представленого в клітці наступним ланцюгом: рецептор серпантинового типу G-білок (Gi або Gs) АЦ цАМФ ПКА ефекторні системи.

Слід зазначити, що дія пептидів інсулінової природи на АЦ в м'язовій тканині молюска здійснюється через АЦ сигнальний механізм, схожий з таким хребетних, але має на пострецепторних етапах трансдукції гормонального сигналу відміну на рівні ПКС. Виходячи з результатів нашого дослідження, в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінового суперсімейства у хребетних бере участь ПКС ?, а у безхребетних (молюски), як передбачається, - ПКС ?.

Експериментально підтверджена, висунута нами гіпотеза, про важливу роль АЦ-цАМФ в реалізації регуляторного дії інсуліну і ІФР-1 на фундаментальні процеси в клітці. Показано участь АЦ-цАМФ системи в здатності ІФР-1 і інсуліну стимулювати клітинний ріст і пригнічувати апоптоз в культурах фібробластоподібних клітин.

Виявлено порушення в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну при патології (цукровий діабет 1-го і 2-го типів).

Теоретичне і практичне значення роботи

Теоретичне і практичне значення роботи визначається важливою роллю інсуліну та інших пептидів інсулінового суперсімейства в організмі вищих і нижчих тварин. Виявлення нових сигнальних механізмів дії пептидів цієї групи, зокрема інсуліну і ІФР-1, розширює сучасні уявлення про спектр сигнальних систем, що беруть участь в регуляторному дії пептидів інсулінового суперсімейства.

Застосування еволюційного підходу (вивчення ряду еволюційно-споріднених пептидів і використання представників хребетних і безхребетних) дозволило виявити консервативність виявленого АЦ сигнального механізму дії пептидів інсулінової природи.

Дані, отримані на безхребетних, можуть бути корисні для розуміння сигнальних механізмів дії пептидів інсулінового суперсімейства у хребетних і для розробки моделей ендокринної патології у людини (цукровий діабет) в рамках нового напряму - «еволюційна біомедицина» (Перцева, 2006).

Отримані дані про молекулярні механізми дії інсуліну і ІФР-1 мають фундаментальне значення і можуть застосовуватися при читанні курсу лекцій в університетах і медичних ВУЗах як в Росії, так і за кордоном.

Результати дослідження мають важливе практичне значення в плані виявлення молекулярних основ етіології і патогенезу цукрового діабету, а також у створенні нових підходів для діагностики цього захворювання. Виявлений нами АЦ сигнальний механізм дії інсуліну, може служити основою для розробки біохімічного тесту, що дозволяє проводити діагностику порушення окремих ланок в молекулярному механізмі дії інсуліну.

Положення, що виносяться на захист

1. Вперше встановлено, що пептиди інсулінового суперсімейства (інсулін, ІФР-1 та ІПП молюска Anodonta cygnea) ГТФ-залежним чином активують АЦ в тканинах хребетних (ссавці, птахи) і безхребетних (молюски) тварин.

2. Реалізація АЦ активуючого дії пептидів інсулінової природи здійснюється через виявлений нами АЦ сигнальний механізм, що включає наступну сигнальну ланцюг: рецептор тирозинкінази Gi-білок (?? - димер) ФМ-3-К ПКС Gs-білок АЦ.

3. За участю АЦ сигнального механізму, що генерує цАМФ, здійснюється регуляторний дію пептидів інсулінової природи на фундаментальні клітинні процеси - стимулюється клітинний ріст і відзначено зниження апоптоз.

4. При ендокринної патології (цукровому діабеті 1-го і 2-го типів) порушується функціонування АЦ сигнального механізму дії гормонів інсулінової природи в основному на рівні Gs-білка і його сполучення з АЦ.

5.Подібність структурно-функціональної організації АЦ сигнального механізму дії пептидів інсулінового суперсімейства у хребетних і безхребетних тварин свідчить про його еволюційної консервативності.

Апробація роботи

Основні результати і положення роботи були представлені і доповідались на наступних конференціях і з'їздах: 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференції Європейського Товариства Ендокринологів (Кордова, Іспанія, 1994; Нідерланди, 1998; Фаро, Португалія, 2000. ; Бонн, Німеччина, 2002); 4-й Симпозіум з нейробіології молюсків (Амстердам, Нідерланди, 1994); Симпозіум з інсуліну, ІФР-1 і інсуліноподібний пептидів (Іспанія, Барселона, 1997); XXXIII Міжнародний конгрес фізіологів (Санкт-Петербург, 1997); 2-й з'їзд Біохімічного Товариства РАН (Москва, 1997); XVII з'їзд фізіологів Росії (Ростов-на-Дону, 1998); конференція "Рецепція і внутрішньоклітинна сигналізація" (Пущино, 1998); З'їзд Біохімічного суспільства Університету Глазго (Глазго, Великобританія, 1999); 18-ий Міжнародний конгрес біохіміків і молекулярних біологів (Бірмінгем, Англія, 2000); 3-тя і 4-я Міжнародні конференція по релаксину і спорідненим пептидів (Брум, Австралія, 2000; Віомінг, США, 2004); XVIII З'їзд фізіологічного Товариства імені І.П. Павлова, Казань, 2001); XI, XII і XIII Міжнародні наради з еволюційної фізіології (Санкт-Петербург, 1996; 2001; 2006); Міжнародна Європейська конференція (Люксембург, 2002); Друга конференція "Ендокринна регуляція фізіологічних функцій в нормі і патології", присвячена 80-річчю від дня народження М.Г. Колпакова. (Новосибірськ. Жовтень, 2002); 1-й з'їзд Товариства Клітинних Біологів (Санкт-Петербург, 2003); Фізіологічний з'їзд (Єкатеринбург, 2004); 1-й З'їзд фізіологів СНД (Сочі, Дагомис, 2005);

Публікації. За темою дисертації опубліковано 75 робіт, в тому числі 36 статей у рецензованих вітчизняних і міжнародних виданнях.

Особистий внесок автора - Експериментальні дані отримані особисто автором або за його безпосередньої участі.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 259 сторінках, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, викладу результатів їх обговорення, заключення, висновків і списку використаних джерел, що включає 285 джерел. Робота ілюстрована 43 рисунками та 35 таблицями.

Основний зміст роботи

Об'єкти і методи дослідження. Об'єктами дослідження служили: 1) представники хребетних - щури Ratus norvegicus лінії Wistar; 2) кури породи російська біла «Леггорн»; 3) представники безхребетних - прісноводний двостулковий молюск Anodonta cygnea; 4) культура клітин міобластів курячих ембріонів; 5) фібробластоподібних культура клітин лінії Swiss 3T3; 6) культура клітин, трансформована з нормальних фібробластів лінії Е1А + сну-ras (клітини, що впадають в апоптоз) і E1A + E1B (клітини, що не впадають в апоптоз).

Методи. У роботі використаний широкий спектр фізіологічних, біохімічних і фармакологічних методів:

- виділення фракцій плазматичних мембран м'язової тканини хребетних і безхребетних тварин з використанням методу диференціального центрифугування (Kidwai et. Al., 1973 з нашими модифікаціями);

- виділення частково очищених мембранних фракцій культури клітин міобластів курячих ембріонів, фібробластоподібних клітин лінії Swiss 3T3, E1A + cHa-ras, E1A + E1B (Плеснёва і ін., 1999; 2003);

- виділення фракції, що містить прімембранной форму цАМФ-ФДЕ (Houslay, 1985).

- визначення активності АЦ з використанням радіоактивного субстрату АЦ реакції - [? 32 P] АТФ (Salomon et al., 1974 з деякими модифікаціями);

- визначення активності цАМФ-ФДЕ, з використанням радіоактивного субстрату [3 H] цАМФ (Ткачук та ін., 1978);

- АДФ-рібозілірованіе гетеротрімерних G-білків холерним і кашлюковим токсинами (Pertseva et al., 1992);

- електрофорез в ПААГ

- іммуноблотінга з використанням моноклональних антитіл для ідентифікації ізоформи ПКС ?;

- визначення рістстимулюючих активності дії інсуліну, ІФР-1, ЕФР і цАМФ по включенню [14 C] тимідину в ДНК культури клітин Swiss3T3 (Баркан та ін. 1992; Плеснёва і ін., 1997; 1999);

- використання моделі апоптозу на трансформованих клітинах, отриманих з нормальних ембріональних фібробластів введенням пари комплементірующіх онкогенов E1A + cHa-ras, що володіють високою проапототіческой чутливістю до видалення ростових факторів (Bulavin et.al., 1999) і її характеристика (Плеснёва і др., 2003 );

- оцінка антиапоптотического дії інсуліну, ІФР-1 і цАМФ з використанням методу клоногенних виживання культури клітин E1A + cHa-ras (Плеснёва і ін., 2003);

- визначення активності ферментів вуглеводного метаболізму - глікогенсинтетазу і глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази (Кузнєцова, 1998; Кузнєцова та ін., 2004);

- визначення вмісту білків методом Лоурі;

- створення моделей експериментального діабету 1-го і 2-го типів у хребетних (Ping et al., 1999 року з нашими модифікаціями) і діабетоподобного стану у безхребетних (Плесньова і ін., 2006; Кузнєцова та ін., 2007) з використанням стрептозотоцином.

- статистичні методи обробки даних за програмами (Statgraph і Anova).

Результати дослідження та їх обговорення

В роботі представлені експериментальні докази активуючого дії інсуліну, ІФР-1 та ІПП на АЦ, встановлена ​​структурно-функціональна організація АЦ сигнального механізму в клітці і його роль в регуляції пептидами інсулінової природи клітинного росту і апоптозу.

Основні етапи роботи полягали в дослідженні:

- дії пептидів інсулінової природи на активність АЦ при різному часі і різної концентрації in vitro і in vivo;

- участі прімембранной цАМФ-ФДЕ у функціонуванні АЦ сигнального механізму дії інсуліноподібний пептидів;

- ланок АЦ сигнального механізму (від рецептора до ефекторних систем);

- ролі АЦ сигнального механізму, як в регуляції клітинних процесів, так і його функціонального застосування в умовах патології;

Вплив in vitro інсуліну, ІФР-1 та ІПП на активність АЦ в тканинах хребетних і безхребетних і в культурах клітин в різні часові терміни

Проведено дослідження in vitro динаміки в часі АЦ активуючого ефекту інсуліну, ІФР-1 та ІПП молюска при концентрації пептидів 10 -8 М і для порівняння епідермального ростового фактора (ЕФР), пептиду НЕ інсулінової природи, що володіє рецептором тірозінкіназной типу (Нікольський та ін., 1987). Показано, що в мембранної фракції скелетних м'язів щурів найбільше виражене підвищення продуктивності лікарських досліджених пептидів на АЦ проявляється через 2.5 хв. Активує АЦ ефект інсуліну становить + 236%. Ефект менш виражений при дії ІФР-1 (+ 201%), ЕФР (+ 186%) і ІПП молюска + 124% (Рис. 1; Таблиця 1).

Мал. 1. Концентрація пептидів - 10 -8 М Активація АЦ пептидами (у%) в порівнянні з базальної активністю ферменту, прийнятої за 100%, наведена в тексті. Відмінності достовірні (р <0.05)

Таблиця 1. Динаміка в часі дії ІФР-1 на активність АЦ в мембранної фракції скелетних м'язів щурів

впливу

Активність АЦ (пкмоль цАМФ / хв / мг білка)

2.5 хв

5 хв

10 хв

Без ІФР-1

71.2 ± 4.8

(100%)

85.11 ± 3.3

(100%)

101.20 ± 9.24

(100%)

+ ІФР-1

214.31 ± 12.1

(301%)

136.16 ± 5.2

(160%)

96.14 ± 4.6

(95%)

Примітка: У дужках - базальна активність АЦ (без впливів), прийнята за 100% і активність АЦ (в%) при дії ІФР-1

У мембранної фракції культури курячих міобластів показано (рис. 2), що стимулюючий АЦ ефект інсуліну через 2.5 хв становить + 256%, в порівнянні з базальної активністю, прийнятої за 100% і має схожість з даними, отриманими на мембранної фракції скелетних м'язів щурів ( + 236%) (рис. 1).

У тканинах молюска A.cygnea, ІПП, виділений з вісцеральних органів цього молюска, надає найбільш виражене підвищення продуктивності лікарських на АЦ (+ 422%), в порівнянні з ЕФР (+ 221%), ІФР-1 (+ 169%) і інсуліном ( + 133%) (Рис. 3; Таблиця 2). Слід зазначити, що активує АЦ ефект досліджуваних пептидів найбільшою мірою проявляється через 2,5 хв, через 5 хв знижується, а через 10 хвилин практично відсутня (Таблиця 2; Рис. 3).

Мал. 2. Концентрація інсуліну 10 -8 М. Відмінності достовірні (р <0.05)

Таблиця 2. Динаміка в часі дії ІФР-1 на активність АЦ в мембранної фракції гладких м'язів молюска

впливу

Активність АЦ (пкмоль цАМФ / хв / мг білка)

2.5 хв

5 хв

10 хв

Без ІФР-1

110.21 ± 10.8

(100%)

125.31 ± 9.3

(100%)

106.04 ± 6.6

(100%)

+ ІФР-1

259.92 ± 11.4

(269%)

229.31 ± 5.2

(183%)

103.81 ± 5.8

(98%)

Примітка - як в таблиці 1.

Таким чином, в мембранних фракціях, виділених з м'язових тканин досліджуваних тварин і культури клітин курячих міобластів, спостерігається закономірність прояву ефекту пептидів в залежності від часу дії. Інсулін, ІФР-1, ІПП і ЕФР надають підвищення продуктивності лікарських на АЦ протягом 2,5 і 5 хв з максимальним ефектом через 2.5 хв. АЦ активуючий ефект досліджуваних пептидів видоспецифичен. У скелетних м'язах щурів ряд ефективності пептидів за їхнім впливом на АЦ має наступний порядок: інсулін> ІФР-1> ЕФР> ІПП, а в м'язових тканинах молюска - ІПП> ЕФР> ІФР-1> інсулін.

Мал. 3. Концентрація пептидів - 10 -8 М Активація АЦ пептидами (у%) в порівнянні з базальної активністю ферменту, прийнятої за 100%, наведена в тексті. Відмінності достовірні (р <0.05)

Вплив in vivo різних доз інсуліну на активність АЦ в тканинах хребетних і безхребетних в різні часові терміни

Виявивши в дослідах in vitro стимулюючий вплив пептидів інсулінового суперсімейства на активність АЦ, ми досліджували вплив інсуліну, основного представника інсулінового суперсімейства, на активність АЦ в різних дозах і при різному часі дії в умовах in vivo. Експерименти проведені на фракціях м'язових мембран щурів, курячих ембріонів і молюсків після введення інсуліну (внутрішньочеревно або внутріжелточно) в дозах 0.05 нг / г-10 нг / г ваги тіла (вага щури або курячого ембріона, вага молюска без раковини). Доза, що вводиться in vivo інсуліну розраховувалася з урахуванням концентрації інсуліну, використовуваної в дослідах in vitro. Підставою для вибору дози служили дані літератури і результати наших дослідів in vitro. Було показано, що в скелетних м'язах щурів стимулюючий АЦ ефект інсуліну (+ 222%) виявляється через 5 хв після введення гормону (1 нг / г), а через 15 хв він знижується майже в три рази (67%) (Рис. 4) . При більш високих доз інсуліну (10 нг / г), що стимулює АЦ ефект гормону через 5 хв виявляється слабше (+ 124%), а через 15 хв був відсутній.

Мал. 4. Активація АЦ пептидами (у%) в порівнянні з базальної активністю АЦ, прийнятої за 100%, наведена в тексті. Відмінності достовірні (р <0.05)

В експериментах in vivo в мембранних фракціях м'язів курячих ембріонів різного віку виявлено АЦ активуючий ефект інсуліну. У 10-денних курячих ембріонів він виявлявся вже через 5 хв, більш чітко виражений через 15 хв, а через 30 хв не проявлявся (рис. 5).

Мал. 5. Відмінності достовірні (р <0.05)

У 17-денних курячих ембріонів виявлено дозозалежне підвищення продуктивності лікарських інсуліну на активність АЦ через 5 хвилин (Рис. 6), яке слабшає через 15 і 30 хв після введення гормону.

Мал. 6. Відмінності достовірні (р <0.05)

При введенні молюскам інсуліну (0.5 нг / г і 5.0 нг / г) активність АЦ зростала через 5 хв після введення гормону на + 49% і + 381%, відповідно, в порівнянні з контролем, прийнятим за 100%. Через 20 хв вплив гормону (0.5 нг / г) на активність АЦ знижується (+ 22%) і практично зникає (+ 6%) через 40 хв (Рис. 7). При введенні інсуліну (5 нг / г) молюскам АЦ стимулюючий ефект гормону через 20 хв становив + 110%, а через 40 хв + 50% (рис. 7).

Мал. 7. Світлі стовпчики - базальна активність АЦ. Заштриховані стовпчики - інсулін-стимульована активність АЦ при різних дозах гормону. Відмінності достовірні (р <0.05)

З отриманих нами даних випливає, що виразне вплив інсуліну на активність АЦ в м'язових мембранах молюска (Рис. 7) виявляється при більш високій дозі інсуліну, ніж у ссавців і птахів. Це можна пояснити тим, що у молюска A.cygnea рецептори до інсуліну не виявлені (Лейбуш, Чистякова, 2003), а ефект інсуліну може реалізовуватися через ІФР-1 - подібні рецептори або рецептори ІПП молюска, які здатні опосередковувати активуючий вплив інсуліну на АЦ ( Шпаков і ін., 2005).

Слід зазначити, що прояв АЦ стимулюючого впливу інсуліну і інсуліноподібний пептидів в часі має схожість в дослідах in vitro і in vivo. АЦ активуючий ефект пептидів чітко виявляється при коротких термінах впливу пептиду (2,5 і 5 хв) при фізіологічних концентраціях (10 -9 -10 -8 М), зі збільшенням часу дії ефект пептидів слабшає або відсутній.

АЦ активуючий ефект інсуліну, ІФР-1 та ІПП при різних концентраціях в умовах in vitro

Встановивши оптимальний час дії пептидів інсулінового суперсімейства, при якому відбувається активація АЦС (2.5 хв), необхідно було виявити при яких концентраціях АЦ стимулюючий ефект пептидів найбільш виражений. У різних тканинах стимулюючий ефект пептидів інсулінової природи здійснюється через специфічні рецептори, що відрізняються по спорідненості до пептиду в гомологічних і негомологічних пептиду тканинах.

Проведено дослідження впливу інсуліну, ІФР-1, ІПП молюска і ЕФР протягом 2.5 хв при різних концентраціях (10 -1 2 -10 -6 М) в мембранних фракціях щурів, курей, молюсків, а також у фракції, виділеної з культури клітин курячих міобластів.

У мембранної фракції скелетних м'язів щурів стимулюючий АЦ ефект інсуліну, ІФР-1, ІПП виявляється при концентраціях - 10 -11 -10 -7 М (Рис. 8). Найбільш виражений АЦ стимулюючий ефект становить: для інсуліну + 250% при 10 -8 М; для ІФР-1 + 91% при 10 -9 М; для ІПП + 111% при 10 -8 М; для ЕФР + 190% при 10 -10 М. (Рис. 8).

Можна відзначити, що в діапазоні концентрацій 10 -10 -10 -7 М найбільш чітко виражений що активує АЦ ефект інсуліну, ефекти інших досліджених пептидів інсулінової природи виявлялися слабший. АЦ стимулюючий ефект ЕФР проявлявся при більш низьких концентраціях (10 -11 -10 -10 М).

Мал. 8. Базальна активність АЦ прийнята за 100%. Час дії пептидів 2.5 хв

Таблиця 3. Вплив in vitro різних концентрацій інсуліну на активність АЦ у фракціях м'язових мембран курячих ембріонів різного віку і курчат

Об'єкти (вік)

10-сут

ембріони

13-сут

ембріони

16-сут

ембріони

курчата

3-сут

впливу

Активність АЦ (пмоль цАМФ / хв / мг білка)

У дужках - Активність АЦ (в%) в присутності інсуліну, по відношенню до базальної активності, прийнятої за 100%.

без

інсуліну

14.021.10

(100%)

3.900.45

(100%)

2.010.09

(100%)

8.520.41

(100%)

+ інсулін

10 -11 М

16.341.35

(117%)

4.210.34

(108%)

4.810.46

(239%)

10.110.55

(119%)

+ інсулін

10 -10 М

39.141.93

(279%)

10.330.89

(265%)

5.280.30

(263%)

11.240.48

(132%)

+ інсулін

10 -9 М

48.252.21

(344%)

15.921.24

(408%)

10.240.62

(509%)

14.540.82

(171%)

+ інсулін

10 -8 М

19.871.44

(142%)

9.840.56

(252%)

9.920.47

(494%)

19.551.13

(238%)

+ інсулін

10 -7 М

17.130.98

(122%)

4.930.45

(126%)

7.510.33

(374%)

22.211.37

(261%)

+ інсулін

10 -6 М

17.901.12

(128%)

5.120.21

(131%)

1.950.22

(97%)

24.391.62

(286%)

Вивчення АЦ стимулюючого ефекту пептидів інсулінового суперсімейства і ЕФР в онтогенезі дозволило виявити такі факти. Найбільш виражений АЦ активуючий ефект інсуліну (10 -11 М-10 -6 М виявляється у курячих ембріонів (10, 13, 16 діб) і курчат (3 доби) при концентрації гормону 10 -9 М, і становить у 10-добових ембріонів + 244%, у 13-добових + 308%, у 16-добових + 409% (Таблиця 3), а у 3-х добових курчат (+ 186%) при більш високій концентрації 10 -6 М, що може бути пов'язано з переходом ембріонів в постембріональний період, коли процеси росту і диференціювання закінчуються.

Проведені нами дослідження дії інсуліну і ІФР-1 на активність АЦ в мембранної фракції, виділеної з культури клітин курячих міобластів (4-й день розвитку) показали, що найбільший АЦ стимулюючий ефект інсуліну (+ 352%) виявляється при концентрації 10 -9 М, а ІФР-1 (+ 289%) при концентрації 10 -10 М (дані в дисертації).

У мембранної фракції м'язів молюска АЦ стимулюючий ефект інсуліну, ІФР-1, ІПП і ЕФР виявляється при концентраціях - 10 -11 -10 - 8 М (Рис. 9). Інсулін і ІФР-1 надають найбільш виражену стимулюючу дію на активність АЦ при концентрації 10 -8 М (+ 63% і + 54%, відповідно), а ІПП і ЕФР при 10 -9 М (+ 415% і + 223%, відповідно ).

Таким чином, визначено діапазон концентрацій, при яких проявляється АЦ активуючий ефект досліджуваних пептидів. Слід зазначити видоспецифичность дії пептидів. Дія ІПП, виділеного з вісцеральних гангліїв молюска A. cygnea, є більш ефективним в тканини молюска і менш ефективним в тканинах хребетних.

Мал. 9. Базальна активність АЦ прийнята за 100%. Час дії пептидів - 2.5 хв.

Участь ц-АМФ-залежної ФДЕ в механізмі дії пептидів інсулінового суперсімейства

Рівень цАМФ в клітці залежить не тільки від АЦ - ферменту, що здійснює його синтез, але і від фосфодіестерази (ФДЕ) - ферменту, що забезпечує його деградацію. Досліджено динаміку в часі активності прімембранной форми цАМФ-ФДЕ у фракції скелетних м'язів курей. Ця ізоформа ФДЕ локалізована на внутрішній стороні мембрани і здатна активуватися інсуліном (Houslay, 1985). Нами показано, що активність прімембранной цАМФ-ФДЕ не змінюється через 2.5 і 5.0 хв після дії інсуліну, збільшується на + 115% через 10 хв і на + 179% через 20 хв, в порівнянні з базальної активністю ферменту, прийнятої за 100% (Таблиця 4).

Таблиця 4. Вплив інсуліну (10 -8 М) на активність прімембранной цАМФ-ФДЕ в скелетних м'язів курей залежно від часу

впливу

Активність цАМФ-ФДЕ (нмоль АМФ / хв / мг білка)

2.5 хв

5.0 хв

10.0 хв

20.0 хв

без інсуліну

3.37 ± 0.5

(100%)

3.70 ± 0.33

(100%)

3.56 ± 0.61

(100%)

3.21 ± 0.28

(100%)

+ інсулін

3.06 ± 0.21

(91%)

4.07 ± 0.18

(110%)

7.65 ± 0.23

(215%)

8.95 ± 0.44

(279%)

Примітка: в дужках представлена ​​активність цАМФ-ФДЕ (в%) в присутності інсуліну і базальна активність ферменту, прийнята за 100%

При дослідженні дії різних концентрацій інсуліну (10 -9 М-10 -7 М) виявлено, що найбільш виражену дію гормону (+ 115%) на активність цАМФ-ФДЕ виявляється через 10 хв при концентрації 10 -8 М (дані в дисертації).

Співвідношення активності систем АЦ-цАМФ і цАМФ-ФДЕ в реалізації дії інсуліну на клітину є важливим моментом в розумінні внутрішньоклітинних механізмів функціонування пептидів інсулінової природи.

При активації АЦ гормонами швидкість синтезу цАМФ починає перевищувати швидкість його деградації. Підвищення рівня цАМФ призводить до активації мішені його дії - ПКА. Спорідненість ПКА до цАМФ в 100-1000 разів більше, ніж у ФДЕ. При посиленні синтезу цАМФ відбувається спочатку насичення цАМФ-регуляторних центрів ПКА, і лише потім гідроліз цАМФ за участю фосфодіестерази.

Виходячи з представлених нами даних, що активують ефекти інсуліну на АЦ і цАМФ-ФДЕ чітко розділені в часі. АЦ активуючий ефект інсуліну проявляється через 2,5 і 5 хв і відсутня через 10 хв. Тим часом, цАМФ-ФДЕ активується інсуліном лише через 10 хвилин інкубації з гормоном. Таким чином, активація цАМФ-ФДЕ настає лише тоді, коли цАМФ як вторинний посередник виконає свою функцію, досягне порогового рівня і здійснить своє підвищення продуктивності лікарських на ПКА, а потім і на ефекторні системи (Ткачук, 1983), що узгоджується з нашими даними про дії інсуліну на активність АЦ і цАМФ-ФДЕ і даними літератури.

У зв'язку з цим основна увага буде приділена дослідженню АЦС, що бере участь в здійсненні регуляторного дії пептидів інсулінового суперсімейства на клітинні процеси.

Використання антіінсуліновие сироватки для доказу специфічності АЦ стимулюючого ефекту інсуліну

Для доказу АЦ стимулюючого дію інсуліну, а не інших пептидних гормонів, що не відносяться до гормонів інсулінового суперсімейства, була використана анти-інсулінова сироватка (АІС), вироблена в лабораторії на інсулін ссавців, яка нейтралізує дію інсуліну і, як встановлено нами пригнічує стимулюючу дію інсуліну на АЦ. При додаванні нормальної сироватки (без інсуліну) до фракції скелетних м'язів щурів і гладких м'язів молюска, який активує АЦ ефект інсуліну становить + 68% у щурів і + 41% у молюсків. При використанні АІС стимулюючий АЦ ефект інсуліну відсутня у щурів (+ 7%) і молюсків (-5%) (Табл. 5).

Отримані дані свідчать про те, що виявлене нами підвищення продуктивності лікарських інсуліну на АЦ в м'язових тканинах досліджуваних об'єктів здійснюється саме інсуліном і є специфічним при дії цього гормону.

Таблиця 5. Нейтралізація АЦ стимулюючого ефекту інсуліну в мембранних фракціях скелетних м'язів щурів і гладких м'язів молюска в присутності антіінсуліновие сироватки

впливу

Активність АЦ (пкмоль цАМФ / хв / мг білка)

Нормальна сироватка

Анти-інсулінова сироватка

Гладкі м'язи молюска Anodonta cygnea

без інсуліну

111.186.13 (100%)

148.294.31 (100%)

Інсулін 10 -8 М

156.768.54 * (141%)

158.678.16 (107%)

Скелетні м'язи щури

без інсуліну

97.344.58 (100%)

115.826.49 (100%)

Інсулін 10 -8 М

163.496.17 * (168%)

110.037.12 (95%)

Примітка: наведені дані з трьох незалежних експериментів, повторених три рази. Значення представлені у вигляді середнього арифметичного з урахуванням помилки середнього. Відмінності достовірні (р <0.05 (*). У дужках - активність АЦ в%. Базальна активність прийнята за 100%.

Наступна частина роботи присвячена розшифровці структурно-функціональної організації механізму АЦ активуючого дії інсуліну і ІФР-1.

У цій частині роботи ми поетапно досліджували ланки, які можуть бути залучені до реалізації дії інсуліноподібний пептидів, починаючи від рецептора і закінчуючи ефекторними системами, які є кінцевою ланкою реалізації сигналу.

Участь рецептора тірозінкіназной типу в реалізації АЦ стимулюючого ефекту пептидів інсулінового суперсімейства

Для доказу участі рецептора тірозінкіназной типу, характерного для пептидів інсулінового суперсімейства в реалізації АЦ стимулюючого ефекту пептидів інсулінової природи, використовували селективні інгібітори рецепторних тирозинкіназ - тірфостін 47 і генистеин, які блокують тірозінкіназная функцію рецептора інсуліну та інших пептидів інсулінової природи. Інгібітори інкубували з пробами протягом 15 хв після чого в пробу додавали пептиди (час дії 2.5 хв) при концентрації, що викликає максимальний АЦ стимулюючий ефект. Вплив цих інгібіторів на активують АЦ ефекти інсуліну, ІФР-1, ЕФР і для порівняння на ефект изопротеренола (в разі хребетних) і серотоніну (в разі безхребетних), які також діють активує чином на АЦ, але через рецептор серпантинового типу, вивчали in vitro у фракції мембранних препаратів м'язової тканини щурів, культури курячих міобластів, молюсків.

У щурів в присутності тірфостіна 47 (1.25-5.0 мкм) активує АЦ ефект пептидів знижувався при дії інсуліну до 50%, при ІФР-1 до 65%, при ЕФР до 50% по відношенню до максимального ефекту пептидів, прийнятому за 100% (Рис . 10). У присутності генистеина (1.25-5.0 мкм) зниження АЦ стимулюючих ефектів всіх використовуваних пептидів у щурів було більш виражено. Ефект інсуліну знижувався до 40%, ефект ІФР-1 до 10%, ефект ЕФР - до 18% (рис. 11). У той же час у щурів стимулюючий ефект изопротеренола на АЦ (10 -6 М) практично не змінювався в присутності тірфостіна 47 і генистеина (0.5-20.0 мкм).

У культурі клітин 4-х добових курячих міобластів тірфостін 47 (Рис. 12) і генистеин (дані представлені в дисертації) інгібували АЦ активуючий ефект інсуліну до 43% і 38%, відповідно. Однак, підвищення продуктивності лікарських изопротеренола на АЦ в присутності інгібіторів тирозинкіназ (тірфостіна 47 і генистеина) нічого не змінено (р <0.05). Це свідчить про те, що класичні рецептори серпантинового типу не беруть участі в механізмі дії пептидів інсулінової природи.

Мал. 10. По осі ординат - зниження стимулюючого ефекту пептидів і изопротеренола на АЦ (прийнятого за 100%) в присутності тірфостіна 47

Мал. 11. По осі ординат - зниження стимулюючого ефекту пептидів і изопротеренола на АЦ (прийнятого за 100%) в присутності генистеина

Мал. 12. По осі ординат - зниження стимулюючого ефекту інсуліну і изопротеренола на АЦ (прийнятого за 100%) в присутності тірфостіна 47

Мал. 13. По осі ординат - зниження стимулюючого ефекту пептидів і серотоніну на АЦ (прийнятого за 100%)

Мал. 14. По осі абсцис - концентрація генистеина в мкМ; по осі ординат - зниження АЦ стимулюючого ефекту пептидів і серотоніну (прийнятого за 100%) в присутності генистеина

У молюсків найбільш виражене зниження АЦ стимулюючого ефекту пептидів спостерігалося в присутності тірфостіна 47 (2.5 мкМ). Ефект інсуліну зменшувався до 20%, ефект ЕФР до 30-35%. (Рис. 13). У присутності генистеина АЦ стимулюючий ефект пептидів знижувався до 25% в разі інсуліну (1.25 мкМ генистеин), і до 50-75% у разі ЕФР (5 мкМ генистеин) (рис. 14).

Необхідно підкреслити, що у молюсків A. cygnea активність АЦ збільшується не в присутності изопротеренола, а в присутності серотоніну, що реалізує свою дію також через рецептори серпантинового типу (Pertseva et al., 1992). Дослідження дії інгібіторів тирозинкіназ - тірфостіна 47 і генистеина (0.5-20.0 мкм) на стимулюючий АЦ ефект серотоніну в мембранної фракції м'язових тканин молюсків не виявило змін у дії цього біогенного аміну на активність АЦ.

Таким чином, в мембранної фракції щурів, молюсків і культури клітин курячих міобластів стимулюючий вплив досліджуваних пептидів на АЦ знижувалося в присутності тірфостіна 47 і генистеина в діапазоні концентрацій - 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ у всіх досліджуваних об'єктах (Рис. 10 14).

Стимулююча дія изопротеренола (щури, кури) або серотоніну (молюски) на АЦ, що реалізовується через рецептори серпантинового типу не змінювалися в присутності тірфостіна 47 або генистеина в досліджуваних об'єктах (див. Рис. 10-14).

Можна зробити висновок, що в м'язовій тканині ссавців (щури), птахів (кури), культурі клітин курячих міобластів і в м'язах молюсків підвищення продуктивності лікарських інсуліну, ІФР-1, ЕФР на АЦ здійснюється за участю рецепторів тірозінкіназной типу, специфічних для дії цих пептидів. (Pertseva et al., 1996; Plesneva et al., 2003).

Участь G-білків в реалізації АЦ стимулюючого ефекту інсуліну

Для доказу участі G-білків в дії інсуліну на активність АЦ був застосований широко поширений підхід, в якому використовується набір гуанінових нуклеотидів, здатних по-різному або стимулювати ГТФ-азну активність G-білків у присутності ГТФ і його аналогів - ГТФ? S, ГІДФ і тим самим активувати АЦ, або пригнічувати ГТФ-азну активність G-білка в присутності ГДФ? S.

Було досліджено вплив ГТФ і ряду його негідролізуемого аналогів на активність АЦ в присутності і відсутності гормону (Табл. 6).

Таблиця 6. Вплив гуанінових нуклеотидів у відсутності і присутності інсуліну на активність АЦ у фракції м'язових мембран щура і молюска

впливу

тварини

Щур

молюск

Активність АЦ (%)

контроль

100 ± 1.01%

100 ± 1.3%

Інсулін (10 -8 М)

222 ± 1.3%

(+ 122%)

186 ± 1.8%

(+ 86%)

ГТФ? S (10 -5 М)

242 ± 1.4%

(+ 142%)

470 ± 9.4%

(+ 370%)

ГІДФ (10 -5 М)

236 ± 1.8%

(+ 136%)

269 ​​± 4.9%

(+ 169%)



>

ГТФ (10 -5 М)

135 ± 1.05%

(+ 35%)

163 ± 5.1%

(+ 63%)

ГДФ? S (10 -5 М)

95 ± 1.2%

(-5%)

92 ± 2.4%

(-8%)

Інсулін + ГТФ? S

473 ± 2.5%

(+ 373%)

[109%]

726 ± 20.3%

(+ 626%)

[170%]

Інсулін + ГІДФ

399 ± 8.2%

(+ 299%)

[41%]

441 ± 12.3%

(+ 341%)

[86%]

Інсулін + ГТФ

277 ± 10.1%

(+ 177%)

[20%]

279 ± 8.4%

(+ 179%)

[30%]

Інсулін + ГДФ? S

102 ± 5.4%

(+ 2%)

[-17%]

105 ± 4.3%

(+ 5%)

[-86%]

Примітка: в круглих дужках - активує АЦ ефект використовуваних агентів в% по відношенню до базальної активності, прийнятої за 100%. У квадратних дужках - потенціювання ефекту гормону в присутності гуанінових нуклеотидів в%.

Згідно з представленими даними, ГТФ? S, ГІДФ, ГТФ стимулюють активність АЦ в м'язових мембранах щурів і молюсків. При спільній дії інсуліну і гуанінових нуклеотидів відбувається посилення (потенціювання) ефекту гормону в порівнянні з адитивним ефектом гормону і гуанінових нуклеотидів, що діють окремо - в присутності ГТФ? S, ГІДФ і ГТФ на + 109%, + 41% і + 20% у щурів і на + 170%, 86% і 30% у молюсків (табл. 6). ГДФ? S же навпаки знижує АЦ стимулюючий ефект інсуліну як в м'язах щурів, так і молюсків.

Потенціювання ефекту інсуліну в присутності ГТФ? S, ГІДФ, ГТФ та відсутність потенціюють в присутності ГДФ? S свідчить про залучення Gs-білків в АЦ сигнальний механізм дії пептидів інсулінового суперсімейства.

Таблиця 7. Вплив коклюшного і холерного токсинів на базальну, інсулін і ІФР1-стимулюється активність АЦ в скелетних м'язах щури і молюска A. cygnea

Активність АЦ (пкмоль цАМФ / хв / мг білка)

впливу

Скелетні м'язи щури

Гладкі м'язи молюска

без КТ

+ КТ

без КТ

+ КТ

без пептидів

39.7 ± 3.4

48.5 ± 2.0

63.2 ± 4.1

69.1 ± 9,6

(100%)

(100%)

(100%)

(100%)

інсулін

67.9 ± 3.6

48.2 ± 2.7

200.5 ± 14.4

74.2 ± 7.6

10 -9 М

(171%)

(99%)

(317%)

(108%)

ІФР-1

57.4 ± 2.1

43.1 ± 1.6

139.2 ± 12.4

76.8 ± 7.3

10 -9 М

(145%)

(89%)

(220%)

(111%)

без ХТ

+ ХТ

без ХТ

+ ХТ

без пептидів

39.6 ± 2.6

79.7 ± 2.7

47.4 ± 3.0

94.3 ± 5.6

(100%)

(100%)

(100%)

(100%)

інсулін

69.3 ± 2.8

105.8 ± 7.4

151.7 ± 9.8

134.0 ± 7.5

10 -9 М

(175%)

(133%)

(320%)

(142%)

ІФР-1

56.7 ± 4.2

106.2 ± 6.5

100.0 ± 5.4

122.6 ± 8.8

10 -9 М

(143%)

(133%)

(210%)

(130%)

Примітка: У дужках - активність АЦ в%. Активність АЦ без пептидів прийнята за 100%.

Для з'ясування типів G білків, залучених до АЦ сигнальний механізм дії інсуліну і ІФР-1 були використані бактеріальні токсини (коклюшний і холерний), які модифікують? -субодиниці Gi і Gs білків.

Коклюшний токсин викликає АДФ-рібозілірованіе? I-субодиниці Gi білка, що веде до втрати його функціональної активності (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Відомо, що ?? - димер Gi білка володіє власною регуляторної здатністю і може стимулювати активність ФМ-3-К. Обробка м'язових мембран щура і молюска кашлюковим токсином приводила до блокування АЦ стимулюючого ефекту, як інсуліну, так і ІФР-1 (таблиця 7), що можна пояснити порушенням дисоціації гетеротрімерного Gi білка на? I-субодиницю і ?? димер в умовах дії коклюшного токсину.

Таким чином, коклюшний токсин, запобігаючи индуцируемую інсуліном або ІФР-l стимуляцію активності ФМ-3-К, реалізовану через ?? - залежний механізм, гальмує активацію АЦ.

Вплив холерного токсину на мембрани призводить до блокади ГТФ-азной активності? S-субодиниці і тим самим переводить її в перманентно активований стан. У зв'язку з цим обробка мембран холерним токсином може спричинити за собою стимулювання каталітичної активності АЦ і поряд з цим ослаблення регуляторних ефектів гормонів, дія яких на АЦ здійснюється через Gs білок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обробка фракції м'язових мембран щура і молюска холерним токсином призводить до 2х-кратного збільшення базальної активності АЦ і зниження стимулюючого ефекту інсуліну і ІФР-1 на активність ферменту (таблиця 7), що повністю узгоджуються з відомостями літератури і вказує на залученість Gs білка в активацію АЦ за участю інсуліну або ІФР-1.

Таким чином, сукупність даних, отриманих з використанням коклюшного і холерного токсинів, вказує на участь як Gi, так і Gs білків в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну і ІФР-l.

Участь фосфатидилинозитол-3 кінази в реалізації АЦ стимулюючого ефекту інсуліну і ІФР-1

Для з'ясування участі ФМ-3-К в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінового суперсімейства (інсуліну і ІФР-1) був використаний специфічний інгібітор цього ферменту - вортманнін. Інкубація м'язових мембран щура і молюска з вортманніном (10 -9 -10 -7 М) дещо знижує базальну активність АЦ (таблиця 8). У відсутності інгібітора інсулін і ІФР-1 чітко стимулюють активність АЦ. Тим часом, АЦ стимулюючий ефект інсуліну та ІФР-1 знижується в залежності від концентрації інгібітора (10 -9 -10 -7 М). Інгібуючу дію вортманніна було найбільш виражено при концентрації 10 -7 М (таблиця 8). Встановлені факти свідчать про участь ФІ-3-К в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну і ІФР-1 в м'язових тканинах досліджуваних об'єктів.

Таблиця 8. Вплив вортманніна (10 9 М-10 7 М) на стимуляцію ІФР-1 (10 8 М) і інсуліном (10 8 М) активності АЦ в мембранної фракції скелетних м'язах щурів і гладких м'язів молюска Anodonta cygnea

Активність АЦ (пкмоль цАМФ / хв / мг білка)

об'єкти

щури

молюски

впливу

без пептиду

ІФР-l

інсулін

без пептиду

ІФР-l

інсулін

без ворманніна

21 ± 1.6

38.2 ± 1.0 *

41.4 ± 2.3 *

17.8 ± 1.0

41.1 ± 2.6 *

24.5 ± 1.0 *

+ вортманнін

10 9 М

17.9 ± 2.0

9.4 ± 1.3

9.7 ± 1.4

15.8 ± 2.0

14.6 ± 1.3

14.2 ± 0.4

+ вортманнін

10 8 М

16.5 ± 2.3

8.6 ± 1.3

8.4 ± 1.3

14.6 ± 2.3

13.9 ± 0.8

11.6 ± 1.0

+ вортманнін

10 7 М

13.2 ± 1.9

6.3 ± 0.9

6.8 ± 0.8

14.3 ± 0.9

13.8 ± 1.8

7.4 ± 0.5

Примітка: значення активності АЦ в присутності пептидів, достовірно відрізняються від активності ферменту у відсутності пептидів (р <0.05), відзначені зірочкою.

Для перевірки гормоноспеціфічності інгібуючої дії вортманніна на АЦ стимулюючі ефекти інсуліну і ІФР-1 були використані ізопротеренол і серотонін, гормони неспоріднені пептидів інсулінової природи і реалізують дію через рецептор серпантинового типу, не пов'язаний з ФМ-3-К сигнальною системою. Результати цих дослідів показали відсутність впливу вортманніна на катехоламінчувствітельную АЦ сигнальну систему (дані наведені в дисертації). Цей факт вказує на участь ФІ-3-К в, виявленим нами, АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну і ІФР-1.

Участь протеїнкінази С в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінового суперсімейства

Для доказу участі ПКС в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінової природи використовували селективний блокатор ПКС - кальфостін (Yoing et al., 2005). У відсутності кальфостіна АЦ активуючий ефект інсуліну та ІФР-1 становив + 101% і + 73% у щурів, і + 78% і + 86% у молюсків відповідно, по відношенню до базальної АЦ, прийнятої за 100%. Як виявлено нами, кальфостін (10 -10 -10 -8 М) блокував АЦ стимулюючі ефекти інсуліну і ІФР-1 в мембранних фракціях м'язів щура і молюска.Найбільш виражений інгібуючий ефект кальфостіна виявляється при концентрації 10 -8 М. В присутності кальфостіна (10 -8 М) АЦ стимулюючий ефект інсуліну та ІФР-1 знижувався на 46% і 32% у щурів, і на 47% і 50% у молюсків, відповідно, по відношенню до максимального АЦ стимулюючого ефекту пептидів, прийнятому за 100% (дані в дисертації).

Для ідентифікації ізоформи ПКС, що бере участь в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінової природи використовували моноклональні антитіла до ПКС ?, яка за даними літератури є одним з учасників реалізації сигналів інсулінової природи.

Таблиця 9. Вплив антитіл до ПКС? на АЦ активуючий ефект ІФР-1 (10 -8 М) і інсуліну (10 -8 М) в м'язових мембранах щура і молюска A.cygnea

Активність АЦ (

об'єкти

щури

молюски

воздейтсвия

без пептиду

ІФР-1

інсулін

без пептиду

ІФР-1

інсулін

без антитіл

100 ± 4.4

253 ± 17

247 ± 24

100 ± 12

307 ± 24

255 ± 18

АТ 1: 1000

104 ± 9.5

102 ± 14

108 ± 16

166 ± 25

251 ± 21

254 ± 12

АТ 1: 100

98 ± 8.2

95 ± 12

103 ± 5

163 ± 18

327 ± 27

237 ± 20

АТ 1:10

94 ± 6.8

68 ± 3.6

88 ± 8

145 ± 5

403 ± 33

238 ± 25

Активність АЦ виражена в% до контрольних величин, прийнятим за 100%.

Антитіла до ПКС? майже повністю блокували АЦ стимулюючий ефект інсуліну та ІФР-1 в м'язових мембранах щурів (таблиця 9). Таким чином, використання моноклональних антитіл до ПКС? показало, що ця ізоформа ферменту залучена в стимулюючу дію інсуліну і ІФР-1 на АЦ в скелетних м'язах щурів. Тим часом, в гладких м'язах молюска ці антитіла не надавали блокуючого дії на АЦ стимулюючий ефект інсуліну та ІФР-1. М'язи молюска володіють іншим набором ПКС (Sossin et а1., 1996) і в АЦ стимулюючу дію цих пептидів інсулінового суперсімейства, мабуть, бере участь інша ізоформа ПКС, близька за своїми властивостями до ПКС? з мозку хребетних.

Таким чином, даний дослідження привело до виявлення і розшифровці раніше невідомого АЦ сигнального механізму дії інсуліну, ІФР-1 та ІПП молюска в м'язових тканинах хребетних і безхребетних тварин. Цей механізм має принципово подібну структурно-функціональну організацію в разі інсулін- ІФР-1 та ІПП-компетентних АЦ сигнальних систем. Він може бути представлений в клітці шестікомпонентним сигнальним каскадом: рецептор тирозинкінази Gi-білок (?? - димер) фосфатидилинозитол-3-кіназа протеинкиназа З Gs-білок аденилатциклаза. АЦ є генератором внутрішньоклітинного посередника - цАМФ, який здатний через активацію цАМФ-залежної протеїнкінази "A" передавати гормональний сигнал до різних еффекторним системам.

У плані вивчення функціональної ролі, виявленого нами, АЦ сигнального механізму, що генерує цАМФ, було досліджено його участь в реалізації регуляторного дії пептидів інсулінової природи на такі фундаментальні клітинні процеси, як клітинний ріст і апоптоз.

Участь АЦ сигнального механізму в мітогеном дії пептидів інсулінової природи

Для вивчення мітогенного дії пептидів інсулінового суперсімейства ми використовували фібробластоподібних культуру клітин Swiss 3T3, люб'язно надану нам з банку культур Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург). Проведена функціональна характеристика АЦ системи в культурі Swiss3T3 клітин. Встановлено, що АЦ система в культурі цих клітин

Таблиця 10. Функціональні властивості АЦС культури Swiss3T3 клітин

впливу

активність АЦ

(Пкмоль цАМФ / хв / мг білка)

Стимулюючий АЦ ефект в%

базальна

30.59 ± 1.41

100% (базальна)

NaF 10 -2 М

178.91 ± 4.15

585% (+ 485%)

форсколин 10 -5 М

99.26 ± 3.21

324% (+ 224%)

ГІДФ 10 -6 М

111.20 ± 3.48

364% (+ 264%)

ГТФ 10 -5 М

82.98 ± 2.92

271% (+ 171%)

ЕФР 10 -9 М

168.31 ± 4.75

550% (+ 450%)

ІФР-1 10 -9 М

102.14 ± 3.34

334% (+ 224%)

Інсулін 10 -9 М

74.89 ± 2.11

245% (+ 145%)

У дужках - активує АЦ ефект агентів гормональної та негормональной природи (в%), по відношенню до базальної активності АЦ, прийнятої за 100%, стимулюється класичними негормональними активаторами АЦ - NaF, форсколина, ГІДФ, ГТФ, а також інсуліном, ІФР-1 і ЕФР (таблиця 10).

Проведені нами дослідження показали, що в культурі Swiss 3T3 присутній АЦС з функціональними властивостями, близькими до АЦС інших клітин і тканин хребетних, яка здатна до сприйняття позаклітинних сигналів різної природи.

Оцінивши функціональні властивості АЦ сигнальної системи культури Swiss3T3 клітин, була досліджена здатність інсуліну, ІФР-1 і ЕФР індукувати в культурі клітин Swiss3T3 мітогенний ефект, оцінюваний по включенню [14 C] -тімідіна в ДНК (Рис. 15-1). Показано, що інсулін (1000 нг / мл), ІФР 1 (50 нг / мл) і ЕФР (10 нг / мл) стимулювали синтез ДНК (приріст від 100% до 250%).

Досліджувані пептиди в тих же концентраціях надавали стимулюючий вплив (2,5 хв) на активність АЦ. (Рис. 15-2). Для підтвердження участі цАМФ в реалізації мітогенного ефекту був використаний його дібутіріловий аналог цАМФ, який має здатність проникати в клітку. Цей аналог, взятий при низьких концентраціях (10 -12 -10 -9 М), викликав чіткий мітогенний ефект, по величині навіть перевершує аналогічний ефект ЕФР і ІФР-1. Ефект оцінювали по включенню [14 C] -тімідіна в ДНК (Рис. 15-3).

Представлені експериментальні дані підтверджують нашу гіпотезу (Перцева, 2000) про участь АЦ сигнального механізму дії пептидів інсулінового суперсімейства і, що виділяється їм цАМФ, в реалізації мітогенних процесів.

Участь аденілатціклазного сигнального механізм в антиапоптотическое дію інсуліну і інсуліноподібний фактор росту 1

Нами підібрана модель апоптозу, що включає клітинні лінії, з різним ступенем стійкості до умов, що викликають незапрограмованих загибель клітин (апоптоз). В експериментах використовували культуру клітин E1A + cHa-ras, яка має велику проапоптотіческой чутливістю до видалення ростових факторів і дії ДНК-агентів, що ушкоджують ( «впадають в апоптоз») (Bulavin et al., 1999) і культуру клітин Е1А + Е1В з високою стійкістю як до дії ДНК пошкоджуючих агентів, так і до видалення ростових факторів з середовища ( «не впадають в апоптоз»). У клітинних культурах була охарактеризована чутливість АЦС до дії інсуліну і ІФР-1 (Таблиця 11).

Отримані результати свідчать про те, що клітини культури ліній Е1А + сну-ras і Е1А + Е1В здатні відповідати на дію інсуліну і ІФР-1 (10-8м) активацією АЦ, що вказує на наявність в них рецепторів інсуліну і ІФР-1, а також АЦС, чутливої ​​до цих пептидів. Клітини зберігають чутливість АЦС до інсуліну і ІФР-1 як в середовищі з 10% сироваткою, так і в середовищі з 0.5% сироваткою.

Згідно з даними літератури пептиди інсулінового суперсімейства - інсулін і ІФР-1, а також цАМФ, що утворюється в результаті активації АЦ, здатні надавати антиапоптотическое дію на клітини.Показано, що інсулін (10-7М), ІФР-1 (10-8м) і дібутіріл-цАМФ (10-9м) надають інгібуючий вплив на апоптоз, викликаний видаленням ростових факторів сироватки, в культурі клітин E1A + cHa-ras (Плесньова, 2003). Оцінка антиапоптотического ефекту інсуліну, ІФР-1 і дібутіріл-цАМФ проводилася на клітинах культури E1A + cHa-ras з використанням методу клоногенних виживання, який відноситься до числа найбільш чутливих способів тестування антиапоптотического дії агентів. Виявлено, що культивування

Таблиця 11. Вплив інсуліну і ІФР-1 на активність АЦ в грубій мембранної фракції культур клітин E1A + cHa-ras і E1A + E1B

умови

Активність АЦ (пмоль цАМФ / хв / мг білка)

In vitro

E1A + cHa-ras

(Клітини, що впадають в апоптоз)

Е1А + Е1В

(Клітини, що не впадають в апоптоз)

контроль

інсулін

ІФР-1

контроль

інсулін

ІФР-1

Середа + 10% сироватка

33.93.4

(100)

48.12.1

(142)

56.41.3

(166)

4.90.5

(100)

14.31.2

(292)

17.61

(359)

Середа + 0.5%

сироватка (апоптоз)

95,93,4

(100)

137,09,0

(143)

181,68,2

(189)

26.70.5

(100)

61.41.2

(230)

86.32.1

(323)

In vivo

E1A + cHa-ras

(Клітини, що впадають в апоптоз)

Е1А + Е1В

(Клітини, що не впадають в апоптоз)

контроль

інсулін

ІФР-1

контроль

інсулін

ІФР-1

Середа + 10%

сироватка

4.10.29

(100)

6.00.9

(146)

12.20.5

(297)

5.20.3

(100)

8.51.0

(163)

11.41.3

(219)

Середа + 0.5%

сироватка (апоптоз)

11.01.2

(100)

17.21.2

(156)

24.82.2

(225)

5.80.6

(100)

10.00.7

(172)

13.60.6

(234)

Примітка. У дослідах in vitro гормони (10 -8 М) додавали прямо в пробу, яка містить грубу мембранну фракцію клітин, для визначення активності АЦ. Час інкубації 2.5 хв. У дослідах in vivo інсулін (10 -7 М) і ІФР-1 (10 -8 М) додавали до культурам клітин, час інкубації 5 хв. Цифри в дужках - ефект гормонів у відсотках до контролю, прийнятого за 100%. Апоптоз индуцировали видаленням ростових факторів сироватки з середовища.

Трансформантов на середовищі без ростових факторів зменшує число живих клітин, здатних дати потомство в клональний посіві мінімум в 2 рази, в порівнянні з клітинами, культивованими в нормальних умовах (середа + 10% сироватки).

Показано, що тільки 43% культури клітин «виживають» в умовах, коли клітини впадають в апоптоз (середа + 0.5% сироватки) в порівнянні з контролем (середа + 10% сироватка, прийнято за 100%). В експериментах, коли в середу з 0,5% сироваткою був доданий інсулін, ІФР-1 або дібутіріл-цАМФ в зазначених вище концентраціях, здатність клітин давати життєздатне потомство відновлювалася до значень, що складають близько 70% (для інсуліну: 77%, для ІФР -1: 67%, для дібутіріл цАМФ: 66% в порівнянні з контролем, прийнятим за 100%).

Таким чином, експерименти показали здатність інсуліну та ІФР-1 через, виявлений нами, АЦ сигнальний механізм і продукується їм цАМФ, надавати мітогенний і антиапоптотическое дію в клітинних культурах.

Дослідження підтверджують участь АЦ сигнального механізму в реалізації антиапоптотического дії пептидів інсулінового ряду - інсуліну і ІФР-1.

Функціональний стан АЦ сигнального механізму дії інсуліну при цукровому діабеті

На основі концепції молекулярних дефектів в гормональних сигнальних системах як ключових причин ендокринних захворювань (Перцева, 2004) досліджено функціонування АЦ сигнального механізму при експериментальному стрептозотоцинового цукровому діабеті 1-го і 2-го типу у хребетних (щури) і діабетоподобном стані у безхребетних (молюски) .

Діабет викликали одноразовим введенням (i. P.) Стрептозотоцином (80 нг / г ваги тварини). На 30-сут стрептозотоцинового діабету виявлена ​​гіперглікемія в крові щурів, в 4,2 рази перевищує рівень глюкози у контрольних щурів. Вперше виявлено збільшення рівня глюкози в гемолімфі молюсків (в 2,5 рази) на 2-е і 4-е добу розвитку діабетоподобного стану. Виявлено при діабеті зниження АЦ-стимулюючого ефекту інсуліну і його потенцирования гуанінових нуклеотидами у щурів і у молюсків.

Інсулін незалежний діабет (2-го типу) викликали введенням новонародженим щурятами (1-2 діб) одноразово стрептозотоцином (80 нг / г ваги тварини). При цьому типі діабету також виникають порушення в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну. АЦ стимулюючий ефект інсуліну та потенціювання не проявляється.

На підставі отриманих даних виявлено функціональні дефекти в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну при діабеті, в м'язах щурів і молюсків, що зачіпають дистальні ланки АЦ сигнального механізму на рівні каталітичного компонента - АЦ, Gs-білка і його сполучення з АЦ.

висновок

Це дослідження привело до виявлення і розшифровці раніше невідомого АЦ сигнального механізму дії інсуліну, ІФР-1 та ІПП молюска в м'язових тканинах хребетних і безхребетних тварин. Ці оригінальні дані розширюють сучасні уявлення про коло сигнальних шляхів дії пептидів інсулінового суперсімейства і сприяють формуванню нового позитивного погляду на залученість АЦ сигнального механізму в дію гормонів і ростових факторів інсулінової природи, здійснюваного через рецептори тірозінкіназной типу. До наших досліджень в літературі існувала точка зору про участь АЦ сигнального механізму тільки в дії гормонів, що володіють рецепторами серпантинового типу.

Важливими видаються докази, отримані в роботі, про поширеність виявленого АЦ сигнального механізму дії вивчених пептидів в тканинах як хребетних, так і безхребетних тварин. Встановлено принципово подібна структурно-функціональна організація інсулін, ІФР-1 та ІПП-компетентної АЦ сигнальних систем. На сучасному етапі наших досліджень вона представлена ​​в клітці шестікомпонентним сигнальним каскадом: рецептор тирозинкінази Gi-білок (?? - димер) фосфатидилинозитол-3-кіназа протеинкиназа З Gs-білок аденилатциклаза. АЦ сигнальний механізм охоплює стадії від рецептора тірозінкіназной типу до ферменту - АЦ, що є генератором вторинного внутрішньоклітинного посередника - цАМФ. Утворився цАМФ здатний через активацію цАМФ-залежної протеїнкінази "A" передавати гормональний сигнал до різних еффекторним системам.

Відкритий нами АЦ сигнальний механізм дії пептидів інсулінової природи за своєю структурно-функціональної організації поряд зі схожістю, володіє і істотними відмінностями від відомих досі гормональних АЦ сигнальних систем. Ці відмінності зводяться:

- по-перше, до участі в одному АЦ сигнальному механізмі відразу дух типів гетеротрімерних G-білків (Gs і Gi), які зазвичай залучені в різні сигнальні системи;

- по-друге, до взаємодії рецепторів тірозінкіназной типу, специфічних для гормонів інсулінової групи з Gi-білком, що виступає в якості донора ?? субодиниць, а не? i-субодиниці як у багатьох інших сигнальних системах.

- по-третє, до більшого числа, що складають його блоків (шість компонентів, у всякому разі) в порівнянні з трикомпонентним АЦ сигнальним механізмом дії біогенних амінів (рецептор серпантинового типу Gs або Gi-білок АЦ);

За період, що минув з часу виявлення нами АЦ сигнального механізму дії пептидів інсулінового суперсімейства (Plesneva et.al., 1994; Kuznetsova et al., 1999; Plesneva et al., 2001) в літературі з'явилися дані, що стосуються окремих його сигнальних блоків, що підтверджують встановлену нами структурно-функціональну організацію цього АЦ сигнального механізму. Так показано, що рецептори інсуліну і ІФР-1 функціонально пов'язані з Gi-білком (Kuemmerle, Murthy, 2001; Dupont et al., 2003; Kreuzer et al., 2004). Також встановлено участь ФІ-3-К і ПКС і зв'язок їх з продукцією цАМФ в ряді сигнальних шляхів дії пептидів інсулінового суперсімейства (Dessauer, Nguyen, 2005; Nguyen, Dessauer, 2005).

У плані вивчення спектру функцій, виявленого нами АЦ сигнального механізму, що генерує цАМФ, встановлено його участь в реалізації регуляторного дії пептидів інсулінової природи на такі фундаментальні клітинні процеси, як клітинний ріст (стимуляція) (Плесньова і ін. 1999) і апоптоз (інгібування) ( Плесньова і ін., 2003), що сприяють в результаті виживання клітини.

Таким чином, висунута нами гіпотеза (Перцева, 2001) про важливу роль АЦ сигнального механізму в реалізації регуляторного дії інсуліну і ІФР-1 на життєво-важливі клітинні процеси - клітинний ріст, апоптоз знайшла підтвердження в наших дослідженнях (Плесньова і ін., 1999; Плесньова і ін., 2003).

Грунтуючись на еволюційному підході Л.А. Орбелі до всіх досліджуваних явищ (Орбелі, 1958) ми використовували комплекс методів еволюційної фізіології стосовно вивчення біохімічних систем організму. Дослідження включало кілька аспектів: а) вивчення трьох еволюційно споріднених пептидів інсулінового суперсімейства - інсуліну і ІФР-1 хребетних, а також ІПП безхребетних (молюска Anodonta cygnea); б) вивчення дії цих пептидів на АЦС в тканинах-мішенях тварин різного філогенетичного рівня (хребетні - ссавці і птиці; а також безхребетні - молюск Anodonta cygnea); в) частина досліджень (птиці) проведена в онтогенезі; г) досліджені АЦ сигнальні механізми дії пептидів інсулінового суперсімейства та виявлено функціональні порушення в них при патології - цукровому діабеті.

У плані розвивається в лабораторії концепції (Перцева, Шпаков, 2004) молекулярних дефектів в гормональних сигнальних системах як ключових причин ендокринних захворювань проведено дослідження функціональних порушень в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну і ІФР-1, що виникають при цукровому діабеті. Вперше виявлені дефекти в цьому сигнальному механізмі на рівні каталітичного компонента - АЦ, Gs-білка і його сполучення з АЦ, а також ослаблення регуляторних метаболічних ефектів гормону у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом 1-го і 2-го типів.

Використання еволюційного підходу дозволило виявити не тільки існування АЦ сигнального механізму дії ряду пептидів інсулінового суперсімейства у хребетних і безхребетних, а й виявити принципову схожість в його структурно-функціональної організації, що свідчить про еволюційну консервативності цієї сигнальної системи

висновки

1. В м'язових тканинах представників хребетних (щури) і безхребетних (молюски) тварин виявлена ​​чутлива до впливу пептидів інсуліноподібного суперсімейства АЦС. Інсулін, ІФР-1 та ІПП молюска надають ГТФ-залежне підвищення продуктивності лікарських на АЦ. АДФ-рібозілірованіе бактеріальними токсинами дозволило виявити участь G-білків як ингибирующего (Gi-білок), так і стимулюючого (Gs-білок) типів в АЦ сигнальному механізмі дії вивчених пептидів.

2. Встановлено участь рецепторів тірозінкіназной типу, в активуючий дії інсуліну, ІФР-1 та ІПП молюска на АЦС, що веде до утворення внутрішньоклітинного посередника - цАМФ. Показано, що селективні інгібітори рецепторних тирозинкіназ - тірфостін 47 і генистеин, блокують підвищення продуктивності лікарських досліджуваних пептидів на АЦ в м'язах хребетних і безхребетних.

3. Виявлено участь фосфатидилинозитол-3 кінази в АЦ сигнальному механізмі дії пептидів інсулінового суперсімейства, на що вказує блокування активуючого впливу пептидів інсулінової природи на АЦ в присутності специфічного інгібітор ФМ-3-К - вортманніна.

4. Встановлено участь протеїнкінази ПКС ідентифікованої за допомогою моноклональних антитіл в реалізації АЦ стимулюючого дії пептидів інсулінового суперсімейства в м'язових тканинах хребетних.

5. На основі сукупності отриманих даних, зроблено висновок про існування в клітинах хребетних, раніше невідомого АЦ сигнального механізму дії інсуліну і ІФР 1, що включає сигнальну ланцюг: рецептор тирозинкінази Gi-білок (?) Фосфатидилинозитол-3-кіназа ПКС Gs-білок аденилатциклаза . Подібний механізм виявлений в м'язах молюска Anodonta cygnea, що відрізняється тільки изоформой ПКС.

6. Експериментально підтверджено гіпотезу про важливу роль АЦ сигнального механізму в реалізації регуляторного дії інсуліну і ІФР-1 на фундаментальні клітинні процеси. Показана їх здатність стимулювати клітинний ріст (в культурі клітин Swiss3T3) і пригнічувати апоптоз (в культурі клітин Е1А + сну-ras).

7. Виявлення АЦ сигнального механізму дії пептидів інсулінового суперсімейства природи в тканинах-мішенях у представників як хребетних, так і безхребетних тварин, а також схожість в його структурно-функціональної організації вказує на консервативність цього сигнального механізму в еволюції.

8. При ендокринної патології (цукровому діабеті 1-го і 2-го типів) у людини, а також у експериментальних тварин (хребетних і безхребетних) при стрептозотоцинового моделі діабету виявлені функціональні порушення в АЦ сигнальному механізмі дії інсуліну і ІФР-1, локалізовані в основному на рівні G-білка і його сполучення з АЦ.

Публікації за темою дисертації

1. Pertseva MN, Kuznetsova LA, Plesneva SA, Grishin AV, Panchenko VP? -agonist-induced inhibitory-guanine-nucleotide regulatory protein coupling to adenylate in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma // Eur. J. Biochem. Pharmacol. 1992. V. 210. P. 279-286.

2. Перцева М.Н., Плесньова С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.І., Кузнєцова Л.А. Нові дані, що свідчать про участь аденілатціклазной системи в механізмі дії інсуліну і споріднених пептидів // Доповіді Академії наук. 1995. T. 342. №3. C. 410-412.

3. Pertseva MN, Plesneva SA, Shpakov AO, Rusakov Yu.I., Kuznetsova LA Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulin -like peptide // Comp. Biochem. Physiol. 1995. V. 112. P. 689-695.

4. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плесньова С.А. Сучасні досягнення у вивченні сигнальних механізмів дії інсуліну і споріднених йому пептидів // Журн. Евола. биохим. физиол. 1996. T. 32. №3. C. 318-340.

5. Pertseva MN, Plesneva SA, Kuznetsova LA, Shpakov AO, Derkach KV On the tyrosine kinase mechanism of the novel effect of insulin and insulin -like growth factor-I: Stimulation of adenylyl cyclase system in muscle tissues // Biochem. Pharmacol. 1996. V. 52. №12. P. 1867-1874.

6. Плесньова С.А., Баркан Р.С., Решетникова Г.Ф., Кузнєцова Л.А., Перцева М.Н. Аденілатціклазную сигнальний механізм в мітогеном дії інсуліну, інсуліноподібного і епідермального чинників зростання // Доповіді Академії наук, 1999. Т. 368. №6. С. 833-838.

7. Kuznetsova L., Plesneva S., Derjabina N., Omeljaniuk E., Pertseva MN On the mechanism of relaxin action: the involvement of adenylyl cyclase signalling system // Regulatory Peptides. 1999. V. 80. P. 33-39.

8. Плесньова С.А., Кузнєцова Л.А., Омельянюк Є.В., Шпаков А.О., Перцева М.Н. Аденілатціклазную сигнальний механізм дії релаксину // Журн. Евола. биохим. физиол. 2000. T. 36. №6. C. 562-568.

9. Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А. Вплив біогенних амінів і поліпептидних гормонів на активність протеїнкінази А та аденілатциклази в м'язах молюска Anodonta cygnea // Журн. Евола. биохим. физиол. 2001. Т. 37. №5.С. 395-400.

10. Plesneva SA, Shpakov AO, Kuznetsova LA, Pertseva MN A dual role of protein kinase "C" in insulin signal transduction via adenylyl cyclase signaling system in muscle tissues of vertebrates and invertebrates // Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. №10. P. 1277-1291.

11. Плесньова С.А., Шпаков А.О., Кузнєцова Л.А., Перцева М.Н. Роль протеїнкінази С в регуляції процесу трансдукції інсулінового сигналу через аденілатціклазную сигнальний механізм // Російський Фізіологічний журнал ім. І.М. Сеченова. 2001. T 87. №8. C. 1106-1117.

12. Шпаков А.О., Плесньова С.А., Кузнєцова Л.А., Перцева М.Н. Дослідження функціональної організації нового - аденілатціклазного сигнального механізму дії інсуліну // Біохімія. 2002. T. 67. №3. C. 403-412.

13. Pertseva MN, Shpakov AO, Plesneva SA, Kuznetsova LA A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides : involvement of adenylyl cyclase signaling system // Comp. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. №1. P. 11-36.

14. Шпаков А.О., Гур'янов І.А., Власова О.М., Корольков В.І., Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Інгібування синтетичними катіонними пептидами стимулюючого впливу гормонів на функціональну активність аденілатціклазной сигнальної системи // Доповіді Академії наук. 2003. T. 389. №1. C. 127-130.

15. Шпаков А.О., Плесньова С.А., Кузнєцова Л.А., Леонтьєва Е.А. Інсулінрегуліруемая аденілатціклазную сигнальна система в клітинній культурі фібробластів миші лінії L // Журн. Евола. биохим. физиол. 2003. T. 39. №5. C. 438-444.

16. Плесньова С.А., Поспєлова Т.В., Кузнєцова Л.А., Бикова Т.В., Шпаков А.О., Перцева М.Н. Нова інсулінкомпетентная аденілатціклазную сигнальна система як можливий механізм антиапоптотического дії інсуліну і інсуліноподібний фактор росту 1 // Доповіді Академії наук. 2003. T. 393. №4. C. 551-553.

17. Kuznetsova L., Shpakov A., Rusakov Yu., Plesneva S., Bondareva V., Pertseva M. Comparative study of biological activity of insulin of lower vertebrates in the novel adenylyl cyclase test -system // Regulatory Peptides. 2003. V. 116. №1-3. P. 81-86.

18. Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Шпаков А.О., Шарова Т.С. Стимулюючий вплив інсуліну і епідермального фактора росту на активність протеїнкінази А, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази і глікогенсинтетазу в скелетних м'язах курей в ембріогенезі // Журн. Евола. биохим. физиол .. 2004. T. 40. №4. C. 325-333.

19. Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Шпаков А.О., Бондарева В.М., Перцева М.Н. Інсулінрегуліруемая аденілатціклазную сигнальна система скелетних м'язів щура в умовах введення інсуліну in vivo і при інсулінової недостатності, викликаної стрептозотоцинового діабетом // Журн. Евола. биохим. физиол. 2004. T. 40. №4. C. 334-343.

20. Шпаков А.О., Шипілов В.Н., Кузнєцова Л.А., Бондарева В.М., Плесньова С.А., Перцева М.Н. Реактивність аденілатціклазной сигнальної системи нервових гангліїв молюска Anodonta cygnea до серотоніну і адренергическим агонистам // Нейрохимия.2004. T. 21. №3. C. 190-197.

21. Шпаков А.О., Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Перцева М.Н. Про залучення фосфатидилинозитол-3-кінази і протеїнкінази С в аденілатціклазную сигнальний механізм дії релаксину в м'язових тканинах щурів і молюсків // Бюл. експер. біол. мед. 2004. T. 138. №10. C. 420-423.

22. Шпаков А.О., Гур'янов І.А., Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Корольков В.І., Перцева М.Н., Власов Г.П. Використання С-кінцевих пептидів -субодиниці G-білків для дослідження їх функціонального сполучення з рецепторами біогенних амінів в тканинах щурів і молюсків // Биол. мембрани. 2004. T. 21. №6. C. 441-450.

23. Шпаков А.О., Шипілов В.Н., Бондарева В.М., Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Русаков Ю.І., Перцева М.Н. Регуляторний дію споріднених інсуліну нейропептидів молюска Anodonta cygnea на функціональну активність аденілатціклазной сигнальної системи // Нейрохимия. 2005. T. 22. №1. C. 28-37.

24. Шпаков А.О., Шипілов В.Н., Гур'янов І.А., Кузнєцова Л.А., Бондарева В.М., Плесньова С.А., Перцева М.Н. Молекулярні механізми регуляторного дії біогенних амінів на функціональну активність аденілатціклазной сигнальної системи в нервових гангліях молюска Anodonta cygnea // Доповіді Академії наук. 2005. T. 401. №6. C. 829-832.

25. Шпаков А.О., Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Гур'янов І.А., Перцева М.Н. Молекулярні причини зміни чутливості аденілатціклазной сигнальної системи серцевого м'яза до біогенних амінів при експериментальному стрептозотоцинового діабету // Цитология. 2005. T. 47. №6. C. 540-548.

26. Шпаков А.О., Кузнєцова Л.А., Плесньова С.А., Перцева М.Н. Молекулярні механізми зміни чутливості аденілатціклазной сигнальної системи до біогенних амінів при стрептозотоцинового діабету // Бюл. експер. біол. мед. 2005. Т. 140. №9. С. 286-290.

...........



Скачати 91.47 Kb.